血清乙型肝炎病毒表面抗体检测作业指导书

血清乙型肝炎病毒表面抗体检测作业指导书（ELISA）

1. 原理

在微孔条上预包被被纯化乙肝表面抗原，配以酶标记抗原（HBsAg-HRP）及TMB等其它试剂，采用夹心法原理检测人血清（或血浆）中乙肝表面抗体（HBsAb）。

2. 标本采集

2.1 采集前病人准备：受检者应空腹

2.2 标本种类：血清或血浆

2.3 标本要求：采集病人静脉血3ml（可用EDTA抗凝），室温放置不超过4小时，分离血清备用。

3. 标本储存：2-8℃保存不应超过1周，-20℃不应超过3个月，-70℃长期保存，应避免反复冻融。

4. 标本运输：密封，室温运输。

5. 标本拒收标准：污染、标本量不足、严重溶血或脂血标本不宜作此项检测。

6. 试剂

6.1 试剂名称：乙型肝炎病毒表面抗体诊断试剂盒6.2 试剂生产厂家：英科新创（厦门）科技有限公司。

6.3 包装规格：96Test/Kit

6.4 试剂盒组成：

HBsAb微孔板，HBsAb酶标记抗原，HBsAb阳性对照血清，HBsAb阴性对照血清，浓缩洗涤液，底物A，底物B，终止液，封口膜，自封袋。

6.5 试剂储存条件及有效期：2-8℃避光保存，有效期9个月。

7. 仪器设备

7.1 仪器名称：自动酶标仪

7.2 仪器厂家：KHB

7.3 仪器型号：ST360

8. 操作步骤

8.1 平衡：将试剂盒各组分取出，平衡至室温（18-25℃），微孔板开封后，余者及时以自封袋封存。

8.2 配液：浓缩洗涤液配制前充分摇匀（如有晶体应

充分溶解），浓缩洗涤液和蒸馏水或去离子水按1：19稀释后使用。

8.3 编号：将微孔条固定于支架，按序编号。

8.4 加样：分别用加样器在对照孔中加入阴、阳性对照血清各50μl于相应孔中。

8.5 加酶：分别在每孔中加入酶标记抗体50μl，轻拍混匀。

8.6 温育：置37℃温育60分钟，室温平衡5分钟。

8.7 洗涤：用洗涤液充分洗涤5次，洗涤完扣干（每次应保持30-60秒的浸泡时间）。

8.8 显色：每孔加入底物A、B各50μl，轻拍混匀，置37℃暗处15分钟。

8.9 终止：每孔加终止液50μl，混匀。

8.10 测定：用酶标仪单波长450nm或双波长450/630nm测定各孔OD值（用单波长测定时需设空白对照一孔，30分钟内完成测定，并记录结果）。

9. 结果判断与分析

9.1 临界值（C.O.）的计算：临界值=阴性对照孔OD 值N×2.1，阴性对照OD均值大于0.1时应重新试验，小于0.05时以0.05计算。

9.2 结果判定：样品OD值S/C.O>=1者为HBsAb阳性

样品OD值S/C.O<1者为HbsAb阴性10. 质量控制

每次试验用含30mIu/mlHBsAb的质控血清同步检测，S/CO值应在控制范围内；如失控，则要检查试剂效期、储藏温度、试验温度是否正常、操作步骤是否正确，直至重新试验使其在控。

11. 参考范围

阴性或阳性

12. 临床意义

HBsAb阳性表明存在HBV的保护性抗体。

13. 操作性能：灵敏度高，特异性好。

14. 方法局限性：样品显色深浅与样品中抗体的含量没有一定正相关。

15. 注意事项

15.1 每板建议设阴阳性对照血清各两孔，设空白对照时，不加样品及酶标记抗体，其余各步相同。

15.2 洗涤时各孔均须加满，防止孔口内有游离酶未能洗净。

15.3 加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。如果滴加，滴加前应弃去1—2滴。滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。注意勿将试剂滴在孔壁上。

15.4 所有样品都应按传染源处理。

15.5 封口膜使用说明

15.5.1 微孔板拆封后，在取出当天所需的微孔条后，其余微孔条可以封口膜封存以避免受潮。在封存时，注意勿把封口膜粘贴到微孔条底部，以免影响其透光性。

15.5.2 微孔板温育时，以封口膜覆盖孔口，可避免其他因素对实验带来的非预期的影响。

15.6 不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生

错误结果。

16. 当检测系统（仪器）不能工作时，所采取的补救措施：应保证所有操作步骤正确无误；可以比对阴阳对照，肉眼判读；无法准确判读者，应留样待系统正常后复查。

17. 参考文献：中华人民共和国卫生部医政司编。全国临床检验操作规程（第二版）412页。

18. 其它：必须按规定使用经中国药品生物制品检定所检定并贴有“检定合格”防伪标签的试剂。