现代分子诊断技术ppt课件

加入生物素标记的碱性磷酸酶
B
B AP
加入不同的生色或化学发光底物
B
B AP
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荧光标记的引物直接进行PCR检测
引物1
DNA
PCR
引物2
荧光染料
层析
荧光检测
游离引物
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• 分子夹心探针检测
分子夹心探针 (没有荧光)
荧光团
猝灭剂
与目的DNA杂交
发出荧光
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目的DNA
• 原理：
TaqMan探针技术
利用Taq酶的3′ 5′外切核酸酶活性，切断探针， 产生荧光信号，由于探针与模板特异性结合，荧
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• 分离杂交探针的方法：
1. 提取某一病原微生物株系的染色体DNA 2. 限制性内切酶进行酶解 3. 得到的酶解片段克隆进一质粒载体，构建质粒文库 4. 文库中重组质粒的插入片段即可用来分别同病原性
微生物和非病原性微生物的核DNA进行杂交、筛选
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• 核酸杂交的灵敏度和可靠性极高 • 用探针直接同粪便样品、尿样、血样、喉洗液和组
• 通过对人类基因组的解析，发现人与人之间99．99％的碱 基序列都相同，而剩下的0.01%的碱基特征序列则来自于双 亲，据此可用于“亲子鉴定”
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二、细菌性传染病及病毒性疾病的分子诊断技术 • 抗生素的不合理使用 • DNA杂交 • PCR检测 • 噬菌体介导
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DNA杂交
• 设计16SrRNA为探针 • 16SrRNA在细菌中拷贝数极高，高度的保守
性 • 特异性不是很好 • 必须结合PCR技术
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PCR检测
• nested PCR
• 针对目的病原菌的不同保守区段设计多对引
物
每对引物都能特异的扩增出一段目
的片段，病原菌存在的可能性大大增加
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模板
第一次PCR扩 增产物
第二次PCR扩 增产物
使用外引物，进行第一 次PCR扩增
使用内引物，进行第二 次PCR扩增
巢式PCR原理示意图
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• PCR技术也会产生假阳性
1. 新扩增的目的DNA特异性不强 2. 退火温度过低 3. 模板中杂质的污染
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• DNA的杂交探针是一段疟原虫的高度重复的DNA序列 • 具体的分离过程： 1. 构建一个疟原虫的核基因文库 2. 用标记的疟原虫核DNA作探针去筛选核基因文库 3. 选出那些杂交信号最强的克隆 4. 用这些选出来的片段作探针，与疟原虫及其同属中
不导致疟疾的种的核基因作杂交，以检查该片段作 为DNA探针的可靠性
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• 每个重复序列在300个核苷酸长度之内，由于高度重复，序 列经过超离心后以卫星带出现在主要DNA带的附近，所以也 称卫星DNA，其中的重复序列单元则称为“小卫星DNA”
• “小卫星”具有高度的可变性，但在“小卫星DNA “中有 一小段序列则在所有个体中都一样，称为“核心序列”。如 果把核心序列串联起来作为分子探针与不同个体的DNA进行 分子杂交，就会出现各自特有的杂交图谱。它们与人的指纹 一样具有专一性和特异性，因此称作“DNA指纹”
织样品中的目标DNA进行杂交，且无需预先纯化 DNA • 若样品中的目标分子非常少，则需通过PCR将目的 序列扩增，再进行杂交检测
从理论上讲，用DNA杂交来诊断疾病可用 于对所有的致病微生物的检测
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4、非同位素标记探针
• 32P的缺点：
⑴半衰期短，仅13天 ⑵操作起来比较危险 ⑶必须要有特殊的实验室设备进行操作 ⑷放射性垃圾的处理繁琐
• 噬菌体侵染该宿主菌，大量合成包括荧光素酶在 内的由噬菌体基因编码的蛋白，向体系中加入荧 光素和ATP，就会有荧光产生
• 结核菌的检测 • 抗药性菌株的检测
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宿主细菌
噬菌体基因
荧光素酶 基因
利用宿主细胞 转录、翻译
荧光素酶
荧光素＋ATP
荧光
噬菌体介导的细菌检测
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第三节 DNA指纹
❖每个人体细胞内都含 有23对染色体，每条 染色体中部含有一个 DNA分子，DNA分子 中的核苷酸序列包含 着遗传信息，在DNA 分子中存在三种类型： 单拷贝序列、中等程 度重复序列、高度重 复序
光的强弱就代表了模板的数量
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上游
引物
R
5′ 3′
R 5′
wenku.baidu.com3′
Q 3′ 5′
下游 引物 Q
3′
5′
TaqMan探针的荧光信号产生机制
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例一：疟疾的分子诊断：
• 检测是否存在疟原虫
1. 抽取血样进行镜检 2. 免疫诊断:ELISA检测疟原虫蛋白或抗体
无法区分是以前感染还是现在感染
3. DNA杂交诊断
• 假阴性
1. 存在Taq酶的抑制剂
2. 模板量过少 3. 模板DNA纯度不够
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• 原位PCR(in situ PCR,ISPCR ) • 在细胞或细胞切片上对待测的低拷贝数基因进行扩
增，并通过原位杂交进行检测 • 不仅能检测出病原微生物的存在，且能够在组织细
胞中定位
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原位杂交（nucleic acid hybridization in situ）
利用核酸双链的碱基互补、变性和复性的原理， 可以用已知碱基序列的单链核酸片段作为探针，与待 测样本中的单链核酸互补配对，以判断有无互补的同 源核酸序列的存在
核酸探针
是指带有标记的某一特定DNA或RNA片断，能与 待测样本中单链核酸分子互补配对结合，进而检测同 源序列
探针标记物
有放射性核素或非放射性核素（生物素、地高辛、 荧光素等）两大类
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例二： 锥虫的检测
• 锥虫在人体中可侵入肝、脾、淋巴结、中枢神经 系统，在其中大量繁殖并杀死寄主细胞
• 显微镜检新鲜血液 • 取新鲜血液感染未携带锥虫的寄生虫,30-40天
后杀死昆虫,镜检昆虫的肠道 • 免疫检测:假阳性高
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• PCR检测 • 针对锥虫特有的一段188bp的DNA序列设计引
物，特异地从锥虫基因组中扩增得到188bp的 条带
将标记探针与细胞或组织切片中的核酸进行杂交， 进而检测特异的DNA或RNA序列
细胞原位杂交 有 组织切片原位杂交
DNA-DNA RNA-DNA 三类杂交 RNA-RNA 该法优点： 不需提取核酸，故可完整保持组织或细胞的 形态，因而更能准确地反. 映组织细胞的功能状态
噬菌体介导细菌检测
• 将荧光素酶基因引入到噬菌体的基因组，然后用 转基因噬菌体去侵染待测样品
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• 非放射性杂交检测系统： 通过酶促反应将某种底物转变成生色物质或化学
发光物质而达到放大信号的目的 • 采用将生物素（biotin）标记的核苷酸掺入DNA的方
法制备探针 • 生物素标记的DNA在室温下至少可保存一年 • 检测发光和颜色变化可在几小时内完成
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生物素 B
探针
目的DNA
B
加入链霉素抗生物蛋白