病毒的细胞培养

(4) 培养基
• 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的 溶液，分天然培养基和合成培养基。 • 天然培养基： • 天然培养基有血清、血浆、和组织提取液（如鸡 胚和牛胚浸液）。 • 优点：营养成分丰富，培养效果好 • 缺点：来源受限。成分复杂，影响对某些实验产 物的提取和实验结果的分析，易发生支原体污染
五 培养细胞的生长方式及类型
• ㈠ 贴附生长型细胞
必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大
体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难
以确定其稳定形态的细胞。 • ㈡ 悬浮生长型细胞 不需要附着于底物而于悬浮状态下即可生长。
每代贴附生长细胞的生长过程
• 游离期 • 贴壁期 • 潜伏期 • 对数生长期 • 停止期（平台期）
（4）分装、培养
• 将细胞悬液移入细胞培养瓶中，在细胞培 养瓶中加入到10ml DMEM，充分混匀，让 细胞呈单个形式存在，最后将其放入恒温 箱中培养。
2传代细胞的培养
• • • • • （1）细胞的复苏 （2）细胞的传代 （3）细胞的换液 （4）细胞生长状况的观察 （5）细胞的冻存
（1）细胞的复苏 概述
（4）细胞生长状况的观察
• 原理： 应每日或隔日观察一次细胞，及时了 解细胞形态、数量及培养液pH值、污染与 否等情况，以便采取相应的措施处理。
肉眼观察 显微镜观察
（5）细胞的冻存
• 传代细胞应有充足的冻存储备。 • 一则防止细胞因污染等原因造成细胞系的 绝种。 • 二则防止细胞因传的代次太多，造成细胞 衰老或细胞发生变异。
（5）丙酮酸钠、葡萄糖：是属碳水化合物的成分，是细 胞生命的能量来源。 （6）抗生素：最终浓度为青霉素 100 U／ml，链霉素 100U／ml（青霉素为80万U／瓶，将其溶解于4ml三蒸 水中，每升培养液中加人0.5ml；链霉素为100万U／瓶， 将其溶解在5ml三蒸水中，每升培养液加0.5ml）。 （7）冻存液：二甲基亚砜 （8）细胞生长液：是用以维持细胞生长增殖的液体。 其是配方： 基础培养基 80％－90％ 血清 10% 双抗 100u/ml （9）细胞维持液：用以维持细胞缓慢生长或不死的培养 液。 其是配方： 基础培养基 95％ 血清 2％－5％ 双抗 100u/ml
• 5 12h后观察细胞病变，若无明显病变，则每隔3h 观察一次。当有70%细胞发生病变后，将细胞液 反复冻融3次，用吸管反复吹打数次，使病毒完全 从细胞中释放出来
正常形态的鸡胚成纤维细胞
接毒后发生病变的鸡胚成纤维细胞
（4）效价测定
某些病毒具有凝集某种哺乳动物红细胞 的特性，利用该特性而进行的试验称为病 毒的血凝试验。
（2）组织处理
• 用PBS液冲洗胚体2-3次，再将鸡胚的头、 爪、内脏去除，剩下的胚体在用PBS液冲 洗胚体2-3次，然后再放入平皿中，用剪刀 将鸡胚剪成碎块。
（3）消化
• 用PBS液充分冲洗组织碎块2-3次，加入3-5 倍量的胰蛋白酶消化液，置37℃消化10分 钟，每隔2-3分钟轻轻摇动一次。待组织碎 块聚合成团，边缘毛样模糊时取出，轻轻 吸取上层消化液，加适量DMEM培养液， 用吸管反复吹打，使细胞分散。
合成培养基
• 合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数 量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多 种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。
• 合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化 合物、无机盐和其它一些辅助物质。 • 优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本 低 • 缺点： 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生 长需要。
• 在长成致密单层细胞后，将病毒接种在细胞上， 置于适当环境中进行培养，逐日观察细胞病变 （CPE）待75%的细胞出现CPE后收获细胞，反 复冻融3次，置-70℃保存备用。
细胞培养的基本概念
• 传代：细胞在培养器皿中生长一定时间后， 被分开接种到新的培养器皿中。 • 原代培养：取自体内新鲜组织并置于体外 条件下生长的细胞在传代之前称为原代培 养。
细胞冻存方法
• （1）选取对数生长期的细胞，用常规传代的方法 将细胞制成悬液并计数，800-1000r/min离心5min， 弃上清。 • （2）用细胞冻存液将沉淀重悬，调整细胞浓度至 106-107个/ml，分装于冻存管，注明细胞名称，传 代及冻存日期。 • （3）冷冻保存：将冻存管于4℃放置30min，然 后移入-80℃超低温冰箱过夜，再放入液氮罐长期 保存。亦可使用程序降温剂逐渐降温，冻存速度 先为每分钟下降速度1-2℃，当温度达到-25℃时， 可调整下降速度为每分钟5-10℃，温度降至100℃时，再放入液氮罐中长期保存。
病毒的细胞培养
赵健乔
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一 二 三 四 五 六 七
基本原理 细胞培养的基本概念 主要优点 培养实验用品的前期处理 培养细胞的生长方式及类型 细胞培养的实验步骤 病毒的细胞培养
一 基本原理
• 通过机械解离或消化等方法将组织或细胞从机体 取出，分散成单个细胞，给与必要的生长条件。 模拟体内生长环境，使其在体外能继续生长与增 值。
二 主要优点
• • • • • • ㈠ 研究的对象是活的细胞。 ㈡ 研究的条件可以人为的控制。 ㈢ 研究的样本，可以达到比较均一性。 ㈣ 研究的内容便于观察、检测和记录。 ㈤ 研究的范围比较广泛。 ㈥ 研究的费用相对较经济。
三 分类
• 原代细胞培养 • 传代细胞培养
原代细胞培养
• 概念：从供体获取组织细胞后在体外进行 的首次培养。 • 优点：生物学特性未发生很大变化，细胞 染色体仍为二倍体，接近和反映体内生长 特性，适合做药物测试、细胞分化及病毒 学方面的实验 • 缺点：传代次数较多细胞就会衰亡。
传代细胞培养
• 概念：原代细胞经过一系列传代，产生变 异，转化为能够连续传代的细胞。 • 传代细胞可以直接从肿瘤组织获得，又可 以通过人工驯化获得。 • 常用的传代细胞：PK-15、IBRS-2、Vero、 Marc-145、CHO、MDCK、CRFK、Hela 等
Fra Baidu bibliotek
四 培养实验用品的前期处理 1.清洗和浸泡: (1)玻璃器皿 (2)塑料器皿 2.包装 3.消毒：在组织细胞培养技术中，务必保 证组织细胞在无微生物的条件下生长。
（2）病毒分离、繁殖
• 1 将病毒液稀释成多个浓度分别接种在鸡胚中，鸡胚死亡 后收集尿囊液。取效价最高的尿囊液接种细胞。
• 2 将长成单层致密的鸡胚成纤维细胞液倒掉，用PBS反复 清洗3次，将死亡或脱落的细胞洗掉 • 3 取0.5ml处理好的禽流感病毒液注入细胞瓶内，使病毒 液充分铺满瓶底
• 4 将接种病毒后的细胞瓶置于培养箱中感作45 min，将感作后的细胞瓶补加4.5ml营养液后置于 温箱中培养
• 人工合成培养基只能维持细胞生存，要想 使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天 然培养基（如血清）。
• 血清中含有：
• • • • ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等） ②多种金属离子 ③激素 ④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原 等。 • ⑤各种生长因子 • ⑥转移蛋白 • ⑦不明成分
4.细胞培养用液及培养基（液）:
（1）水：蒸馏水、双蒸水，可高压除菌。 （2）平衡盐溶液（PBS)：PH为7.2－7.4，不含钙镁离子 ， 可高压除菌。 （3）消化液 :
胰蛋白酶液：常用胰蛋白酶的浓度为0．25％，pH值7.2左 右。需过滤除菌。
EDTA液：常用浓度为 0．02％，配制时采用无Ca2+、 Mg2+平衡盐液溶解，高压灭菌后即可使用。
• 一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞 可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10 ％血清． • 对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明， 但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚． • 血清质量好坏是实验成败的关键。 • 常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血情、 兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 • 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无 细菌、支原体、病毒污染。 • 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟
七 病毒的细胞培养
• • • • • • 以禽流感感染鸡胚成纤维细胞为例。 （1）病料的处理 （2）病毒分离、繁殖 （3）细胞病变的观察 （4）效价测定 （5）中和实验
（1）病料的处理
采集疑是感染禽流感禽的心、脑、肺、 淋巴结在含有双抗的PBS液中研磨，4℃过 夜，3000r/min离心10min，上清通过 0.22μm抽滤
数量扩大，就必须进行传代（再养）。传代培养也是一种 将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各
种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁
细胞需经消化后才能分瓶。
操作步骤
将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
用1-2ml营养液或PBS缓冲液，清洗培养瓶，倒出
加入1ml含有EDTA的胰酶，清洗五面，倒出 在加入1ml含有EDTA的胰酶，当看到培养瓶上含有
细胞培养常用的培养瓶、 培养皿、6孔板、96孔板
贴附生长型细胞
悬浮生长型细胞
六 细胞培养的实验步骤
1原代细胞的培养 以鸡胚成纤维细胞为例 （1）取胚 （2）组织处理 （3）消化 （4）分装、培养
（1）取胚
• 选取9-11日龄SPF鸡胚，大头朝上直立于蛋 架上，用碘酒、酒精消毒气室外壳。用镊 子从气室端打开蛋壳，撕开壳膜，用无菌 镊子轻轻取出鸡胚，放入灭菌平皿中。
用培养液适当稀释后，接种培养瓶，放入CO2 培养箱静置培养，
次日更换一次培养液。继续培养。如果复苏时细胞密度较高要及时传 代。细胞复苏时细胞数可以做10－20倍稀释，接种密度以5×105 ／ml
为宜。
（2）细胞的传代
原理
在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和（细胞增值
达到一定密度后），为使细胞能继续生长，同时也将细胞
复苏细胞与冻存的要求相反，应采用快速 融化的手段。这样可以保证细胞外结晶在很短的 时间内即融化。避免由于缓慢融化使水分渗入细
胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。
操作步骤
准备好培养瓶、培养液和离心管等放于超净工作台内。 从保存液氮或低温冰箱中冻存管（安瓶）的小袋或冻存盒内取出的 冻存管（安瓶）应直接投入37℃温水中，并轻轻摇动令其内容尽快融 化。 从37℃水浴中取出冻存管或安瓶，离心1000r×1min,用酒精消毒 后开启，用滴管吸出上清液，注入培养液1ml充分混匀，转入刻度离 心管制成细胞悬液后低速离心，除去上清液，必要时再重复用培养液 洗一次。
一两个小空斑，也可看到有灰白色浑浊时，将胰酶倒掉
加入培养液，用移液管吹洗贴有细胞的一面，将细 胞从培养瓶壁上吹下来 然后进行传代
（3）细胞的换液
• 原理：
当细胞的量很少，未能铺满整个生长表 面，但细胞培养液的pH值已经发生很大变 化；或者是细胞形态很差等情况时，需要 给细胞换液。
• 操作步骤 （1）吸弃或倒掉培养瓶内的旧培 养液 （2）加入PBS溶液清洗细胞瓶五 面 （3）加入足量的细胞生长液，放 入37℃、5%CO2培养箱静置培养。