细菌分离纯化及鉴定protocol

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细菌分离纯化培养及鉴定protocol

样品菌株分离:

准备工作

1用报纸将平板包好(约12个一包)灭菌后放入烘箱烘干,最好隔夜;

2按照培养基的配方配制好液体培养基后,调pH值(注意灭菌后培养基pH会略有升高),其中一定体积液体培养基中加入1.5%的琼脂后,倒入锥形瓶并用滤膜封好待灭菌。注意培养基的体积总量不能超过锥形瓶的三分之二,约一半左右;剩余液体培养基加入试管中,每支5ml(其中3ml用于保种,2ml用于提取菌株基因组DNA),用胶塞封好,与加入琼脂的锥形瓶一起灭菌;

3将无菌超净台打开紫外灯灭菌约20分钟,将灭好菌的培养基放置冷却到不烫手后,在超净台中操作倒入到已烘干的培养皿中,每块板中倒入约20ml,厚度约为培养皿的1/3~1/2之间。倒好后的培养皿叠放在超净台内,待培养皿中培养基冷却凝固之后即可使用。暂时不用的,可先用封口膜封好并标记好培养基名称存放好。4在培养皿上写清样品名称,标注日期,姓名。用枪加入100uL液体样品到培养皿上,尽量把培养皿托平,将涂布玻棒插入酒精中取出在酒精灯外焰灼烧完全,待冷却后,在酒精灯下将液体涂布均匀(最好涂布至培养基将液体全部吸收)。

5将涂好的培养皿正置培养2小时后,用封口膜封好,倒置培养。

定时观察平板,描述菌落的颜色、形状,记录菌落数并拍摄照片。划线分离纯化:

1待涂布好的培养皿上长出单菌落后,用挑取同一培养皿中不同颜色、不同形状的菌落进行划线分离纯化,挑取的菌落用记号笔标出。

2将接种针在酒精灯外焰灼烧完全,稍冷却后,在平板上进行Z字形三个方向划线。

3若在新板上又长出新菌落,再次分离划线

4划线需做至少2-3次,直至菌落完全纯化(纯化步骤很关键)

保种:

1 将已纯化的细菌用灭菌的牙签蘸取接种入试管内(注意要取单菌落),摇床150r/min, 28℃培养,直到其生长至指数期

2在2ml冻存管(预先灭菌并烘干)中加入1ml 30%甘油(甘油预先配置好灭菌后待用),再加入1ml上述1中的菌液,盖紧管盖,混匀后在管壁做好样品标记和日期,同时在实验记录本上做好记录3以上每个样做三管,做好记录,放入冷存盒,放入-80度冰箱内,记录存放位置。

4将同一试管内剩余的2ml细菌培养液加入到灭过菌的2ml试管中待提取DNA。

DNA的提取:可采用细菌基因组DNA抽提试剂盒或手提的方法进行

手提法步骤如下:

1、取2mL,8000r/min离心10分钟,弃去上清。

2、加入 2 ml无菌水离心洗涤两次,用2ml无菌水悬浮菌体,混匀,-20℃保存备用。

3、取0.7ml菌悬液,加入37μl 10%SDS,混匀,加入7.4μl 10mg/ml 蛋白酶K,混匀,37℃温育1小时

4、加入148μl 5mol/L NaCl,再加入102μl CTAB/NaCl(质量浓度50 g/ L CTAB ,0.5 mol/ L NaCl),混匀,65℃温育10分钟。

5、加入等体积的氯仿/异戊醇,混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

6、上清中加入等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1),混匀,10000r/min离心5分钟,保留上清。

7、加入0.6倍的异丙醇,混匀,-20℃静置20分钟以上,10000r/min 离心5分钟,收集DNA沉淀,用70%乙醇离心洗涤DNA沉淀。

8、用50 μl 无菌水溶解DNA,4℃保存。

比较了几种方法,该方法对我们实验室的纯菌DNA的提取较好,能提到较高浓度的DNA。

16S PCR反应及其测序:

将已提取的细菌基因组DNA作为模板,1492r,27f作为引物,用TAKARA高保真taq酶做16s PCR反应,其PCR产物纯化(纯化试剂盒)后,即可送去测序;也可以将产物直接拿给测序公司由他们帮忙纯化并测序,其费用会略高一些

-80度冰箱内样品的活化:

将样品从-80度冰箱中取出后,用双手握紧将其迅速冻融,然后用灼烧好并冷却后的接种环蘸取样品,在培养皿中划线培养,待其长出单菌落即可

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