蛋白质的定性定量检测

PAS
苏丹Ⅲ染色
三、免疫组织化学 （immunohistochemistry）
（一）免疫组织化学的概念 （二）免疫组织化学的简要步骤
（三）抗原-抗体反应
（四）免疫标记化学反应与检测
（五）常用免疫组织化学染色方法
（六）免疫组组织化学在临床病理诊断中的应用（S）
（一）免疫组织化学的概念
免疫组织化学： 免疫学与组织化学相结合 的一个分支学科，以免疫学的抗原 -抗体反 应为基础的理论，其可作为蛋白质定位、 定性及半定量检测的方法之一。
抗原的提取 与纯化
免疫动物或细 胞融合，制备 特异性抗体及 纯化
标记物复合 物的制备
观察和记 录结果
抗原抗体反应 和呈色反应
标本的 处理
（三）抗原-抗体反应
抗原-抗体反应：由抗原物质刺激机
体产生相应的特异性抗体后，抗原 和其特异性的抗体在体内或体外发 生结合反应的过程。
利用抗原、抗体在体外可以发生特异 性结合反应的特点，将其应用到细 胞组织化学中，可对各种抗原或生 物活性物质进行分离及检测。
免疫组织化学已被广泛应用于基础科学研 究和临床诊断中。
（二）免疫组织化学的简要步骤
1. 抗体（anbibody，Ab）的制备 （1）抗原的提取和纯化 （ 2）免疫动物制备多克隆抗体或细胞融合 制备单克隆抗体 （3）抗体效价检测和纯化 （4）标记复合物的制备 2. 抗原（antigen，Ag）的检测 （1）细胞或组织切片的制备 （2）免疫组织化学反应和显色 3. 结果观察和记录
检
测
酶等呈色物与一定的底物结合后，可以形成具 有特殊颜色的化合物，即可知道呈色物标记的 抗体与相应的抗原形成的复合物的存在情况。 荧光物质可以在高压汞灯的激发下，发出特定 颜色的荧光，可以在荧光显微镜下被观察到。 胶体金颗粒可以在透射电子显微镜 （transmission electron microscope， TEM） 下观察。 放射性同位素可以使胶片感光，经放射自显影 后就可以知道标记抗体与抗原反应的情况。
（三）电镜术（S）
1. 透射电镜术 2. 扫描电镜术 3. 冷冻蚀刻术
浆细胞透射电镜图
血细胞扫描电镜图
（四）组织（细胞）化学术
（五）免疫组织（细胞）化学术
（六）原位杂交（S）
探针：DNA、RNA、寡核苷酸（ODN）
标记物：放射性核素；非放射性 显示：放射自显影；免疫组化
（七）细胞培养术（S）
Baidu Nhomakorabea
细胞化学技术（S）
细胞化学技术能够对细胞内的各种成分进 行定性、定位、定量研究，包括悬浮胸腹 水细胞、血液细胞以及体外培养细胞均能 产生同样良好的效果。 目前，用细胞化学技术所能显示的化学成 分有蛋白质（显示某些特定蛋白、某些氨 基酸或功能基）、 RNA 、 DNA 、糖类（如 糖原、粘多糖和糖脂等）、脂类（如中性 脂肪、磷脂和固醇等）、酶（如磷酸酶）、 特异抗原（其化学本质可能是多肽、蛋白、 糖蛋白等）、无机盐和微量元素（如铁、 铜、锌、镁等）。
第五章 蛋白质的定性定量检测
第一节 免疫组织化学的基本理论
第二节 蛋白质的定量检测
第三节 免疫印迹法分析特定蛋白质的相对含量 第四节 酶联免疫吸附试验（ELISA）
第一节 免疫组织化学的基本理论
一、形态学研究的方法（S） 二、组织化学 三、免疫组织化学
一、形态学研究的方法（S）
（一） 普通光镜术 （四）组织（细胞）化学术 （二）特殊光镜术 （五）免疫组织(细胞)化学术 1. 荧光显微镜 （六）原位杂交 2. 相差显微镜 （七）细胞培养术 3. 暗视野显微镜 （八）活体与活细胞染色 4. 激光扫描共聚焦显微镜 （九）形态研究的定量术 （三）电镜术 1. 透射电镜术 2. 扫描电镜术 3. 冷冻蚀刻术
（一）普通光镜术（S）
1. 常规方法：
苏木素（Hematoxylin）-伊红（Eosin）染色法/HE染色
2. 特殊染色:
HE染色
心肌细胞光镜图
小脑皮质神经元镀银染色
（二）特殊光镜术（S）
激光扫描共聚焦显微镜技术
始自于上世纪八十年代 的，采用共聚焦显微成 像的原理，在荧光显微 成像的基础上加装了激 光扫描装置，再利用计 算机进行图像处理。可 对组织细胞内部进行立 体断层扫描，达到了动 态观察的一种全新的技 术。有细胞CT之称。
细胞化学染色（S）
原理：细胞中的化学成分和其相应的底物呈一系 列的化学反应，形成于显微镜下可见到的反应产 物。常见的有： 1. 孚尔根反应法（Feulgen reaction）：显示DNA呈 现紫红色。 2. 甲绿-派郎宁法（Methyl Green-Pyronin method）： 显示核酸（甲绿染DNA呈现绿色，派郎宁染RNA 呈现红色）。 3. 苏丹Ⅲ冰冻切片染色：显示中性脂肪呈现橘红色。 4. 普鲁士蓝反应：显示组织中含铁血黄素。 5. 过碘酸雪夫反应（Periodic acid schiff reaction， PAS）：显示糖原和其它多糖物质为紫红色。
（四）免疫标记化学反应与检测
免疫标记化学反应：用荧光素等发光剂、 酶等呈色物或放射性核素等作为示踪物标 记抗体分子，在适宜的条件下（即适宜的 温度和 pH 等），标记抗体与抗原发生特 异性的反应。
常用标记物
1. 荧光素 （ 1 ）异硫氰酸荧光素（ Fluorescein isothiocyanate ， FITC ）： 绿色荧光； （2）四乙基罗达明：橙红色荧光； （3）四甲基异硫氰酸罗达明：橙红色荧光； （4）藻红蛋白：红色荧光 2. 酶 （1）辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）； （2）碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP） 3. 金属标记物：如胶体金，多用于免疫电镜。 4. 放射性核素：涉及污染，防护难，一般不用。
（八）活体与活细胞染色（S）
（九）形态研究的定量术（S）
1. 形态计量术（体视学）
2. 显微分光光度术
3. 图像分析术 4. 流式细胞术
二、组织化学（histochemistry）
组织化学（ histochemistry ）：以组织学为 基础，应用物理和化学的技术方法显示细 胞组织结构中的各种化学成分，并对这些 物质进行定位、定性和定量，从而分析研 究生物体在生理或病理状态下细胞和组织 代谢、功能及形态变化规律的科学。