实验三血清球蛋白的分离纯化及鉴定七年制详解(ppt)
血清白球蛋白的分离、纯化及鉴定ppt课件
从下端管口取1滴洗脱液，滴于20％磺基水杨 酸中，出现白色混浊或沉淀即有蛋白质析出， 开始收集蛋白样品。
从下端管口取1滴洗脱液，滴于BaCl2中，出 现白色混浊或沉淀即有盐分析出，不再收集。
二、G-25凝胶层析脱盐
（一）葡聚糖凝胶G-25层析柱的制备 （二）上样与洗脱：
1、小心控制凝胶柱下端活塞，使柱上缓冲液面刚 好下降到凝胶床表面(注意不要使液面低于凝胶床 表面以致空气进行凝胶床)。
2、关紧下端出口，用滴管吸取盐析球蛋白液，小 心缓慢的加到凝胶床表面上(注意不要将凝胶粒中 冲起或破坏凝胶床表面的平整)。
3、开下端出口，使样品进入凝胶床（刚好下降到 凝胶床表面），关闭出口，小心加入适量pH6.5 的0.02mol/L NH4Ac
血清白蛋白、γ-球蛋白 的分离、纯化及鉴定
分离纯化的一般程序
选择材料 破碎细胞
提取 （预处理） 分离纯化 （粗分级，细分级） 分析及鉴定
实验目的
通过从血清中分离、纯化、鉴定血清 白蛋白和γ-球蛋白的实验，培养学生综合 应用盐析、离心、色谱、电泳分光等技术 来分离纯化特定蛋白质的技能。
实验原理
1. 初分级: 血清经饱和硫酸铵盐析后获得白蛋白 粗分离样品和球蛋白粗分离样品。
再生： 0.3mol/L NH4Ac 20ml， 0.02mol/L
四、醋酸纤维素薄膜电泳检查
样品：
（1 （2）粗分的γ-球蛋白液 （3）粗分的白蛋白液 （4）纯化的γ-球蛋白液：由于此溶液浓度较
低，应多次点样于同一位置（2次），每 次点样时待干后再点。 （5）纯化的白蛋白液
操作步骤： １．准备与点样 2. 电泳 （点样面朝下，110V 1h） ３．氨基黑１０B染色
【优秀版】球蛋白的分离纯化与鉴定PPT
1.盐析：分离球蛋白与清蛋白
取血清0.75 ml，缓慢滴入饱和(NH4)2SO4溶液 0.75 ml， 边加边摇，混匀后于室温中放置10分钟，然后10000rpm 离心10分钟，并小心倾去上清液。沉淀加蒸馏水0.4 ml， 使之溶解，即为粗提的球蛋白溶液。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
（2）浓缩
将纯化的-球蛋白溶液量体积，每毫升加葡聚糖凝胶G-25 干胶，摇动2-3分钟，离心5分钟（10000r/min）， 上清即为浓缩的-球蛋白溶液，留待电泳鉴定。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
三、操作步骤
4.电泳：鉴定-球蛋白及纯度 （比较纯化前后的蛋白质）
• 装柱、上样、洗脱、收集及蛋白质检测等操作步骤及有
关注意事项同前述。
留少量做电泳
•上样前DEAE-纤维素柱的平衡：装柱后用0.02 M乙酸铵 （）冲洗2遍。
• 将脱盐后含球蛋白的溶液加于DEAE-纤维素阴离子交换柱 上，用乙酸铵洗脱，样品进入柱床后立即开始收集洗脱液 ， 检查各管的蛋白质分布情况，合并含量高的各管。 •此次收集的即为纯化的-球蛋白溶液，留待浓缩及鉴定。
三、操作步骤
2.凝胶层析：去除球蛋白中的无机盐 （脱盐）
（1）装柱：
（a）固定层析柱，保持垂直。 （b）排气，并检查是否通畅。柱内留下约5ml乙酸铵。 （c）灌胶：用滴管沿管壁自顶部加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，打
开底部出口，凝胶随柱内溶液慢慢流下而均匀沉降，不断加入 SephadexG-25，至凝胶层积集至约15cm高度即可，床面上保持有少 许溶液。关闭出口。
血清-球蛋白的分离、纯化及鉴定
二、实验原理
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第24页
DEAE－纤维素离子交换层析纯化γ－球蛋白
血清α、β、γ－球蛋白、清蛋白等电点为：
清蛋白pI=4.64，
α2球蛋白 pI=5.06， β球蛋白pI=5.12，
γ球蛋白pI=7.3
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第28页
五、γ－球蛋白判定
用醋酸纤维素薄膜电泳方法，以血 清电泳图谱为对照，判定所分离蛋白质 种类和纯度（参见血清蛋白质醋酸纤维 素薄膜电泳）。
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第29页
蛋白质电离示意图
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第30页
基本原理
1、以醋酸纤维薄膜作为支持体一个电泳方法。 2、在pH8.6巴比妥缓冲液中，血清蛋白质在电场中
血清球蛋白的分离纯化和鉴定
第35页
操作步骤：
1、装置电泳箱。区分电泳箱正负极 。
2、点样：浸于巴比妥溶液中薄膜，滤纸轻轻吸
干 — 半干燥态。
快
铅笔标识；点样器沾适量新鲜血清，垂直点样。
3、放入电泳槽，使膜保持水平。
4、通电：110伏，1小时。断电后，取膜。
5、染色：氨基黑10B染色5min。
6、漂洗：漂洗液浸洗3次，每次5-10min。
沉淀即为初步纯 化γ－球蛋白
倾弃上清液（主要含 α、β球蛋白）
加入0.0175mol/L磷酸缓冲液 （pH=6.3)1ml溶解
γ－球蛋白 粗提液
第9页
二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐
欲去除盐析法分离得到球蛋白粗提液中大量盐， 通常有两种方法：
凝胶层析法、透析
本试验采取葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法 除去球蛋白粗提液中盐硫酸铵，方便下一步用离子交 换层析方法深入提纯球蛋白。
实验三血清γ-球蛋白的分离、纯化及鉴定七年制
的结构分析提供了基础。
序列和结构分析结果解读
根据氨基酸序列，对血清γ-球蛋白的一级结构进 行了深入分析，确定了其基本组成。
利用计算机模拟技术，对血清γ-球蛋白的高级结构进 行了预测，揭示了其可能的折叠方式和空间构象。
一级结构分析 高级结构预测
实验态度培养
实验过程中需严谨细致，实事求是记录数据，培养了我们 的科学态度和实验精神。
团队合作意识
实验操作需要小组成员密切配合，增强了我们的团队协作 意识和沟通能力。
实验不足与改进
在实验过程中，我们也发现了一些不足之处，如样品处理 过程中可能存在的误差、层析柱的平衡问题等，需要在今 后的实验中加以改进和完善。
结果讨论与展望
实验意义
输标02入题
本实验成功分离、纯化了血清γ-球蛋白，为进一步研 究其功能和作用机制提供了材料。
01
未来可以深入研究血清γ-球蛋白与其他蛋白质的相互 作用，以及其在生理和病理过程中的作用，以期为相
关疾病的诊断和治疗提供新思路。
04
03
未来研究方向
05
结论
实验总结
实验原理
本实验基于蛋白质分离纯化的基本原理，通过离子交换层 析和凝胶过滤层析技术，实现了血清γ-球蛋白的分离和纯 化。
03
通过比较肽段的序列信息与数据库中的蛋白质序列， 可以鉴定出蛋白质的身份。
序列分析和结构预测的方法
01
序列分析通过测定蛋白质中每个氨基酸的排列顺序，确定蛋白 质的一级结构。
02
结构预测则基于已知的氨基酸序列，利用计算机模拟技术预测
蛋白质的三维结构。
这些方法对于理解蛋白质的功能和作用机制具有重要意义。
【生物化学实验】血清γ球蛋白分离纯化与鉴定PPT课件
凝胶层析法
透析
本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方 法除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离 子交换层析方法进一步提纯球蛋白。
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凝胶柱层析脱盐
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目的与要求
1.学习了解凝胶 层析的原理
2.熟练了解凝胶 层析的用途
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至15cm。 4、上留1—2mm的水，关闭出口。 注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。
★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降， 使表面平整。
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▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样品 溶液渗入凝胶。
2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收 集洗脱液，用钠氏试剂检测胺。
3、保存：检测洗脱液的蛋白质量，保存含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使铵全部流出，为下次实验做准备。
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注意事项：
1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★ 以管号为横轴，蛋白 质含量为纵轴绘制洗脱 曲线，分析实验结果。
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三、DEAE－纤维素离子交换层析
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凝胶层析原理：
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随流 动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。
凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收 一定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶 质相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时， 直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只能 沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、 流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶网 孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定时 间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目的。
实验三 血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定
实验三血清γ球蛋白的分离纯化与鉴定【实验目的】一.掌握层析技术的基本原理及应用二.了解层析技术的分类三.掌握凝胶层析和离子交换层析的原理【实验原理】一、层析技术1.层析法层析法也称色谱法，是一种广泛运用的物质分离纯化、分析鉴定技术,是1903年俄国植物学家Michael Tswett发现并命名的。
将植物色素溶液通过装有CaCO3 吸附剂的柱子，然后用石油醚淋洗，各种色素以不同的速率流动后形成不同的色带而被分开。
2.依据混合物中各组分理化性质的差异—分子大小、酸碱性、吸附力、分子形状、分子极性、分子亲和力以及分配系数等。
3.基本原理固定相—固定不动。
流动相—对固定相作单向相对运动，推动样品中各组分通过固定相向前移动。
分离原理：待分离混合物中各组分理化性质不同，对流动相和固定相具有不同的作用力，因此在流动相推动样品通过固定相的过程中，通过不断地吸附、解吸、再吸附、再解吸作用，造成混合物中各组分在固定相中的迁移距离不等，达到分离。
4．凝胶层析(凝胶过滤、凝胶色谱、分子筛层析、分子排阻层析)①定义：指混合物随流动相流经固定相的层析柱时，混合物中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。
②基本原理：固定相：凝胶，不带电荷的具有三维空间的多孔网状结构的物质，凝胶的每个颗粒内部都具有很多细微的小孔，如同筛子一样，故称分子筛。
包括琼脂糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺、琼脂糖-葡聚糖复合凝胶。
流动相：洗脱液。
样品加于柱上，样品随洗脱液的流动而向下移动，小分子能进入凝胶孔内部，做不定性扩散运动，流程长，速度慢，后流出；大分子不能进入凝胶孔内部，只能在颗粒间移动，作垂直向下运动，流程短，先流出→大小分子彼此分开。
③影响因素*层析柱的选择及装填：柱大小—分离样品量凝胶型号—分辨率：各种分子筛的孔隙大小分布有一定范围，有最大极限和最小极限。
凝胶分离范围之外的分子，难以分离。
如大小不同的两种全排阻分子/完全渗透分子。
*洗脱液：溶解待分离物质，不变性*加样量：1%～5%*凝胶的再生5. 离子交换层析离子交换层析是利用离子交换剂对各种离子的亲和力不同，借以分离混合物中各种离子的一种层析技术。
07 生物化学实验--血清γ-球蛋白的分离、纯化与鉴定
血清γ- 球蛋白的分离、纯化与鉴定【目的】1 ．掌握盐析 - 层析法提纯血清γ- 球蛋白的原理和技术。
2 ．熟悉电泳比较法定性γ- 球蛋白的方法。
3 ．了解扫描定量γ- 球蛋白的方法。
【原理】蛋白质的分离、纯化是研究蛋白质化学性质及生物学功能的重要手段。
根据不同蛋白质的分子量、溶解度以及在一定条件下带电荷性状的差异来分离、纯化各种蛋白质。
1 ．γ- 球蛋白的分离、纯化（ 1 ）盐析：清蛋白与球蛋白的稳定性不同，故可用盐析法对血清蛋白质初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心所得的沉淀即是球蛋白混合物。
（ 2 ）脱盐：球蛋白混合物中的硫酸铵会妨碍进一步分离纯化，应除去。
脱盐的方法有多种，本试验采用凝胶过滤。
在凝胶过滤中，柱中的填充料是高度水化的惰性多聚物，最常用的有葡聚糖凝胶（ Sephadex Gel ）和琼脂糖凝胶 (Agarose Gel) 等颗粒。
葡聚糖凝胶是具有不同交联度的网状结构物，它的“ 网眼” 大小可以通过交联剂与葡聚糖的配比来达到。
不同型号的葡聚糖凝胶可用来分离和纯化不同分子大小的物质。
把葡聚糖凝胶装在层析柱中，不同分子大小的蛋白质混合液借助重力通过层析柱时，比“ 网眼” 大的蛋白质分子不能进入网格中，而被排阻在凝胶颗粒之外，随着洗脱剂在凝胶颗粒的外围而流出。
比‘ 网眼 ' 小的分子则进入凝胶颗粒内部。
这样，由于不同大小的分子所经路程距离不同而得到分离。
大分子物质先被洗脱出来，小分子物质后被洗脱出来。
所以含硫酸铵的蛋白值溶液通过层析柱时，先被洗脱出层析柱的是球蛋白，小分子硫酸铵由此法分离除去（参见第 2 篇第 2 章图 2-3 ）。
（ 3 ）纯化：γ- 球蛋白与α 、β- 球蛋白（以及微量的清蛋白），等电点不同，所以采用离子交换层析，从球蛋白混合物中分离、提纯出γ- 球蛋白。
用于蛋白质分离的层析材料多是离子交换纤维素，它们的优点是对蛋白质的交换容量较一般的离子交换树脂大，而且品种较多，可以适用于各种分离目的。
血清蛋白、-球蛋白的分离纯化与鉴定
血清清蛋白、γ-球蛋白的分离纯化与鉴定（一）血清清蛋白、γ-球蛋白的分离与纯化【目的要求】1．了解蛋白质分离提纯的总体思路。
2．掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。
【实验原理】血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-β-γ-球蛋白等），由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。
本实验应用不同浓度硫酸铵分段盐析法可将血清中清蛋白、球蛋白初步分离。
在半饱和硫酸铵溶液中，血清清蛋白不沉淀，球蛋白沉淀，离心后清蛋白主要在上清液中，沉淀的球蛋白加少量水可使其重新溶解。
用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。
本实验采用凝胶过滤法，该法是利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异除去粗制品中盐类。
脱盐后的蛋白质溶液再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。
DEAE纤维素为阴离子交换剂，在pH 6.5的条件下带有正电荷，能吸附带负电荷的α-球蛋白和β-球蛋白（pl分别为4.9、5.06和5.12），而γ-球蛋白（pl7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。
提高醋酸铵溶液的浓度到0.06 mol/L，DEAE纤维素层析柱上的ß-球蛋白及部分a-球蛋白可被洗脱下来。
将醋酸铵溶液的浓度提高至0.3mol/L，则清蛋白被洗脱下来，此时收集的流出液即为较纯的清蛋白。
经DEAE纤维素阴离于交换柱纯化的清蛋白、γ－球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。
为便于鉴定，常需浓缩。
浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。
血清清蛋白、γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。
【试剂与器材】1.试剂.（1）饱和硫酸铵溶液：称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70~80℃下搅拌促熔，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵液。
血清免疫球蛋白的提取分离、纯化及鉴定
I 血液及组织样品的制备分析组织中某种物质的含量、探索物质代谢的过程和规律，经常使用动物的肝、肾、脑、粘膜和肌肉等组织，也选用全血、血浆、血清或者无蛋白血滤液等血液样品，有时也采用尿液、胃液等完成各种生化实验。
掌握以上各种实验样品的正确处理和制备方法是保证生化实验顺利进行的关键。
一、血液样品(一）采血测定用的血液，多由静脉采集。
一般在饲喂前空腹采取，因此时血液中化学成分含量比较稳定，采血时所用的针头、注射器，盛血容器要清洁干净；接血时应让血液沿着容器壁慢慢注入，以防溶血和产生泡沫。
(二）血清、全血及血浆的制备1.血清的制备血清是全血不加抗凝剂自然凝固后析出的淡黄清亮液体。
制备方法是：将刚采集的血液直接注入试管或离心管中。
将试管放成斜面，让其自然凝固，一般经3h 血块自然收缩而析出血清；也可将血样放入37 ℃恒温箱内，促使血块收缩，能较快约析出血清。
为了缩短时间，也可用离心机分离（未凝或凝固的均可离心），分离出的血青，用吸管吸出置于另一试管中，若不清亮或带有血细胞，应重离心，加盖冷藏备用。
2.全血及血浆的制备取清洁干燥的试管或其它容器，收集动物的新鲜血液，立即与适量的抗凝剂充分混合，所得到的抗凝血为全血。
每毫升血液中加入抗凝剂的种类可以根据实验的需要进行选择，但是用量不宜过大，否则将影响实验的结果。
将已抗凝的全二于2，000r / min 离心10min ，沉降血细胞，取上层清液即为血浆。
血浆比血清分离得快而且量多：两者的差别，主要是血浆比血清多含一种纤维蛋白原，其它成分基本相同。
3.抗凝剂凡能够抑制血液凝固反应进行的化合物称为抗凝剂。
抗凝剂种类甚多，实验室常用的有如下几种，可根据情况选择使用。
（1）草酸钾（钠）优点是溶解度大，可迅速与血中钙离子结合，形成不溶性草酸钙，使血液不凝固。
每毫升血液用1-2mg 即可。
配制方法：配制10％草酸钾水溶液二吸取此液0.1ml 放入一试管中，慢慢转动试管，泛草酸钾尽量铺散在试管壁上，置80 ℃烘箱烤干（若超过150 ℃则分解），管壁即呈一薄层三色粉末，加塞备用。
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▲ 加样与洗脱
1、加样：用滴管将盐析后样品加入柱床面，打开出口使样 品 溶液渗入凝胶。
2、洗脱：加入洗脱液，打开出口，保持流速10滴/min，收
集洗脱液，每管收集1ml。用奈氏试剂检测
NH4+。
3、保存：20%璜基水杨酸溶液检测洗脱液的蛋白质，保
存 含量高的进一步纯化
▲ 凝胶的再生
不断加洗脱液，使NH4+全部流出，为下次实验做准备
Kd — 分配系数：精确衡量混合物中某一待
分离成分在凝胶柱内的洗脱行为，反映物质分 子进入凝胶颗粒的程度，是溶质分子大小的一 个函数
Ve—洗脱体积：分离物被洗脱时所用的洗脱
液体积
Kd=(Ve-Vo)/Vi
洗脱曲线：以洗脱体积为横坐标，各物质浓 度/吸光度为纵坐标作图
（1）完全被排阻的极端大分子，Ve=Vo，Kd=0 （2）中等分子，Ve=Vo+Kd·Vi，0<Kd<1 （3）完全渗透的小分子，Ve=Vo+Vi， Kd=1
不同蛋白质的分子量、溶解度及在一定条件下，带 电的情况等都有所不同。利用这些性质的差别，可分 离纯化各种蛋白质。
分离蛋白质的方法
分离方法
沉淀法 层析法 电学法
盐析法
有机溶剂沉淀法
电泳法
等电聚焦 超速离心法
离子交换层析
吸附层析
凝胶过滤（分子筛）
亲和层析
在分离纯化时，根据情况选用几种方法，相互 配合才能达到分离纯化一种蛋白质的目的。
实验三血清球蛋白的分离纯化 及鉴定七年制详解(ppt)
（优选）实验三血清球蛋白的 分离纯化及鉴定七年制
【实验方法】
一、盐析法粗分γ-球蛋白 二、凝胶过滤方法脱盐 三、离子交换层析方法纯化γ-球蛋白 四、醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定γ-球蛋白的纯度
【基本原理】
蛋白质的分离、纯化及鉴定是研究蛋白质化学性 质及生物学功能的重要手段之一。
沉淀即为初步纯 化的γ－球蛋白
倾弃上清液（主要含 α、β球蛋白）
加入0.0175mol/L磷酸缓冲液 （pH=6.3)1ml溶解
γ－球蛋白 粗提液
二、葡聚糖凝胶柱层析脱盐
欲去除盐析法分离得到的球蛋白粗提液中大量 盐，通常有两种方法：
凝胶层析法、透析
本试验采用葡聚糖凝胶——Sephadex G 25层析方法 除去球蛋白粗提液中的盐硫酸铵，以便下一步用离子 交换层析方法进一步提纯球蛋白。
“+++”等表示颜色深浅
⑥ 回收凝胶
注意事项：
1 . 凝胶柱的制备质量决定分离效果的好坏 。 2. 加样分离时，滴速越慢，分离效果越好。
★ 以管号为横轴，蛋白 质含量为纵轴绘制洗脱 曲线，分析实验结果。
三、DEAE－纤维素离子交换层析
【实验目的】
1. 通过使用DEAE－纤维素离子交换层析法，进一步 纯化γ-球蛋白脱盐液，得到较纯的γ-球蛋白溶液 2. 学习了解离子交换层析方法的基本原理和应用
盐析步骤
取离心管一支加入血清 2ml
加入2ml 0.9%氯化钠摇匀
边搅拌混匀边缓慢滴加饱和(NH4)2SO4 4ml
静置10min，再离心（5000转/分）10min
上清液（主要含清蛋白） 倾去
沉淀用1ml 0.9%氯化钠搅拌溶解
逐滴加饱和(NH4)2SO4 2ml,摇匀
静置10min，再离心 （5000转/分）10min
能沿着凝胶颗粒间的间隙随流动相向下移动，所以流程短、
流速快，首先流出层析柱；而小分子物质直径小于凝胶
网孔能自由出入，洗脱时间长，后流出层析柱，经过一定 时间层析，分子大小不同的物质彼此分开，达到分离的目 的。
凝胶层析法脱盐
凝胶柱层析脱盐
数学模型
Vo Vi Vt
Vi—凝胶孔内水（内水） Vo—颗粒间水（外水） Vg—凝胶体积 总体积Vt= Vi +Vo+Vg
本实验在半饱和硫酸铵溶液中，清蛋白 溶解，球蛋白将沉淀析出，经离心所得的沉 淀即为球蛋白的粗提液。
盐析法
定义：加入大量中性盐以破坏蛋白质的稳 定因素并使从溶液中沉淀析出的现象。
原理: 破坏蛋白质两个稳定因素： 水化膜和电荷层
中性盐：(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl等。 优点：蛋白质不变性，常用。
【基本原理】
本实验采用硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶过 滤、离子交换层析方法，分离纯化血清γ球蛋白。最后用醋酸纤维素薄膜电泳法鉴定 γ-球蛋白的纯度。
实验思路
分段盐析去除杂蛋白
先
凝胶层析脱盐
粗
后 细
离子交换层析纯化
交联葡聚糖吸水浓缩
醋酸纤维素薄膜电泳鉴定
一、盐析法粗分离血清γ-球蛋白
盐析法是根据不同蛋白质在不同浓度的 中性盐溶液中溶解度不同，分别析出，达到 彼此分离的方法。
凝胶层析原理：P31
凝胶层析法是按混合物各组分分子量大小不同随 流动相经过层析柱的时间不同而被分离的技术。 凝胶是一类具有三维多孔网状结构的干燥颗粒，当吸收一
定量溶液后溶涨成柔软、富有弹性、不带电荷、不与溶质 相互作用的惰性物质，凝胶层析以其为固定相。层析时，
直径大于凝胶网孔的大分子物质不能进入凝胶内部，只
离子交换层析的基本原理
离子交换层析是一种常用的、通过使用各种类型的离 子交换剂达到分离纯化目的的层析方法。离子交换剂是通 过化学反应将带电基团引入到惰性支持物上形成的固体物 质，在实验中作为固定相。如果其带负电，则能结合阳离 子，成为阳离子交换剂；如果其带正电，则能结合阴离子， 称为阴离子交换剂。可根据实验需要，选择不同的离子交 25的准备
▲ 装柱（15~20cm）
1、层析柱保持垂直。 2、放蒸馏水，排出空气，关闭出口。 3、加入搅拌均匀的SephadexG-25悬液，调节流速10滴
/min，使凝胶均匀沉降，不断补充，直至18cm。 4、上留1-2mm的水，关闭出口。
注意：★ 床面上要保持少许水，防止胶床露出液面。 ★ 胶面不平，用玻棒轻轻搅动，让凝胶自然沉降，
脱盐
②上样
γ－球蛋白， 粗提液
③加入洗脱剂
①装柱
葡聚糖凝胶G-25， 柱高18-20cm
④收集
20滴换 一支试管
12
34
流速：每分钟10滴左右 5 6 7 8 9 10
⑤.层析后洗脱液检测
白色比色板,洗净备用。 一块在各孔滴加奈氏试剂（检测NH4+）,另一
块滴加20%璜基水杨酸（检测蛋白质）。 不用滴管,避免污染,直接倒… 用“-”表示无现象，用“+”, “++”,