实验十四18SrDNA在人类染色体上的免疫荧光原位杂交(选做,
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（1）剪取适当大小的带有正电荷的尼龙膜 （Roche）。 （2）将标记探针分别稀释至原浓度的10－1、10－2、 10－3、10－4和10－5，分别点各浓度稀释物和若干 已知DIG标记DNA浓度的样品各1 L于膜上。 （3）在80 ℃下烤膜2 h，使DNA固定于膜上。 （ 4）将膜置于封堵缓冲液中，浸泡2 min。封堵缓 冲液成分为含有1×封堵剂（Blocking Reagent， Roche）的马来酸缓冲液（ 0.1 mol/L 马来酸， 0.15 mol/L NaCl，pH 7.5）。 （5） 以 1 ∶ 2 0 0 0 稀 释 抗 体 Anti-digoxigenin-APconjugate（alkaline phosphatase，AP）于上述
（6）将尼龙膜转移至封堵溶液中，浸泡1 min。 （7）使尼龙膜在冲洗缓冲液（ Washing Buffer） （含 0.3 ％ Tween-20 的马来酸缓冲液）中晃动 1 min。 （8） 在 检 测 缓 冲 液 （ Detection Buffer）（0.1 mol/L Tris-Cl，0.1mol/L NaCl，pH 9.5） 中 平 衡1 min。 （9）将 40 L NBT/BCIP 储存液（ Roche）稀释于 2 mL检测缓冲液中。 （10）将尼龙膜转移至显色缓冲液中，黑暗中显色5 min～30 min。 （11）对照各杂交点的颜色深浅，判断标记混合物 中探针浓度。
实验十四
18S rDNA在人类染色体上的 免疫荧光原位杂交
(选做，综合性实验，自我设计， 开放性实验 18学时）
什么是免疫荧光原位杂交
原位杂交（in situ hybridization）是一种在显微或 亚显微结构水平上对某些特异的DNA或RNA片段 进行定位研究的技术，是研究基因定位，基因扩 增和基因表达的最重要，最直接和最有效的手段。 免疫荧光原位杂交技术就是其中的一种。这种方 法比较简便,能够检测出中期或间期染色体上各种 长度的DNA片段和单一中期染色体上的DNA片段， 被认为是进行基因定位研究的最快速和最有效的 方法之一。
实验原理
由于抗体和抗原间的特异性反应，抗Bio 或 抗Dig抗体便与探针分子中的Bio 或Dig结合。 在荧光显微镜下，抗Bio 或抗Dig抗体因携 带有一定数量的荧光素分子而发出一定颜 色的荧光，籍此，细胞学制片中待测的 DNA或RNA片段被定位。
常用的荧光素染料
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC） 四乙基罗达明B-200（lissamine rhodamine B-200，RB-200） 四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TMRITC）
染色体标本预处理
（ 1 ）每张载玻片上滴加 100 L RNA 酶（ Rnase） （100 g/mL），盖parafilm膜，37 ℃温育1 h。 （2）2×SSC洗载玻片3×5 min。 （3）－20 ℃下70% 85% 100%乙醇系列脱水各5 min后，室温下干燥。 （ 4 ）每张载玻片上滴加 200 L 胃蛋白酶（ Pepsin） （Sangon）（ 含 0 . 0 1 ％ 胃 蛋 白 酶 的 1 0 mmol/L HCl），盖parafilm膜，37 ℃温育10 min。 （5）1×PBS 洗 涤 2 × 5 min，10×PBS 中 包 含 ： 8 ％ NaCl、0.2％ KCl、1.44％ Na2HPO4 和 0 . 2 4 ％ KH2PO4。
杂交
（1）配制杂交液，其组分为：50％去离子甲酰胺， 2 × SSC，50 mmol/L 磷 酸 钠 ， 1 0 ％ 硫 酸 葡 聚 糖 （dextran sulfate，DS），0.1％ SDS和2 ng/L 探针DNA。 （2） 杂交液在沸水中变性 10 min，然后迅速冰 浴至少5 min。 （3）将杂交液滴加到染色体标本上（10 L/片）， 盖上盖玻片，置于37 ℃湿盒中杂交过夜。
接上步
（ 6 ） 加 2 L 0.2 mol/L EDTA pH8.0，2.5 L 4 mol/L LiCl，75 L 冰冷无水乙醇混 匀。 （7）－20 ℃沉淀2 h后，12000 rpm离心15 min。 （8）70%冷乙醇洗涤沉淀两遍。 （9）加入20 L TE溶解沉淀。
探针检测
实验目的
了解免疫荧光原位杂交的基本原理和 意义，掌握细胞免疫荧光原位杂交的 基本条件，方法和步骤。 熟悉染色体上核仁形成区的所在部位Fra Baidu bibliotek及特征，验证杂交位点与NORs的关系
实验原理
免疫荧光原位杂交的基本原理是基于免疫学研究 中抗原和抗体间的特异性反应与常规的荧光显微 镜镜检技术。在这种技术中，用于进行原位杂交 的DNA或RNA探针首先用结合有Bio（botin，生 物素）或Dig（digoxigenin，异羟基洋地黄毒甙） 的核甘酸类似物（Bio-11-dUTP，Bio-11UTP， Dig-11-dUTP，Dig-11-UTP）标记，然后使用结 合有荧光素分子的抗Bio 或抗Dig抗体或抗抗体处 理实施原位杂交后的细胞学制片。
接上步
（ 6 ）用含 50 mmol/L MgCl2 的 1 × PBS 洗涤玻片 5 min。 （7）用含50 mmol/L MgCl2和1％甲醛的1×PBS固 定标本5 min。 （8）2×SSC洗玻片2 min。 （9）在含70％去离子甲酰胺的2× SSC中 65 ℃处 理2 min。 （10）－20 ℃下70% 85% 100%乙醇系列脱水 各5 min后，室温下干燥。
探针标记及纯化 探针标记采用随机引物法标记
（1）纯化后的45SrDNA在沸水中变性10 min。 （2）将变性rDNA立即放至冰水中至少5min。 （3） 加 入 2 L 六 碱 基 随 机 引 物 ， 2 L dNTP （dATP，1mmol/L；dCTP，1mmol/L；dGTP， 1mmol/L；dTTP，0.65 mmol/L；DIG-11-dUTP， 0.35 mmol/L，pH 7.5）（Takara）。 （4） 加 入 Klenow 酶 2 U（Takara）， 加 水 补 足 2 0 L。 （5）37 ℃过夜标记20 h。
（6）将尼龙膜转移至封堵溶液中，浸泡1 min。 （7）使尼龙膜在冲洗缓冲液（ Washing Buffer） （含 0.3 ％ Tween-20 的马来酸缓冲液）中晃动 1 min。 （8） 在 检 测 缓 冲 液 （ Detection Buffer）（0.1 mol/L Tris-Cl，0.1mol/L NaCl，pH 9.5） 中 平 衡1 min。 （9）将 40 L NBT/BCIP 储存液（ Roche）稀释于 2 mL检测缓冲液中。 （10）将尼龙膜转移至显色缓冲液中，黑暗中显色5 min～30 min。 （11）对照各杂交点的颜色深浅，判断标记混合物 中探针浓度。
实验十四
18S rDNA在人类染色体上的 免疫荧光原位杂交
(选做，综合性实验，自我设计， 开放性实验 18学时）
什么是免疫荧光原位杂交
原位杂交（in situ hybridization）是一种在显微或 亚显微结构水平上对某些特异的DNA或RNA片段 进行定位研究的技术，是研究基因定位，基因扩 增和基因表达的最重要，最直接和最有效的手段。 免疫荧光原位杂交技术就是其中的一种。这种方 法比较简便,能够检测出中期或间期染色体上各种 长度的DNA片段和单一中期染色体上的DNA片段， 被认为是进行基因定位研究的最快速和最有效的 方法之一。
实验原理
由于抗体和抗原间的特异性反应，抗Bio 或 抗Dig抗体便与探针分子中的Bio 或Dig结合。 在荧光显微镜下，抗Bio 或抗Dig抗体因携 带有一定数量的荧光素分子而发出一定颜 色的荧光，籍此，细胞学制片中待测的 DNA或RNA片段被定位。
常用的荧光素染料
异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC） 四乙基罗达明B-200（lissamine rhodamine B-200，RB-200） 四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethyl rhodamine isothiocyanate，TMRITC）
染色体标本预处理
（ 1 ）每张载玻片上滴加 100 L RNA 酶（ Rnase） （100 g/mL），盖parafilm膜，37 ℃温育1 h。 （2）2×SSC洗载玻片3×5 min。 （3）－20 ℃下70% 85% 100%乙醇系列脱水各5 min后，室温下干燥。 （ 4 ）每张载玻片上滴加 200 L 胃蛋白酶（ Pepsin） （Sangon）（ 含 0 . 0 1 ％ 胃 蛋 白 酶 的 1 0 mmol/L HCl），盖parafilm膜，37 ℃温育10 min。 （5）1×PBS 洗 涤 2 × 5 min，10×PBS 中 包 含 ： 8 ％ NaCl、0.2％ KCl、1.44％ Na2HPO4 和 0 . 2 4 ％ KH2PO4。
杂交
（1）配制杂交液，其组分为：50％去离子甲酰胺， 2 × SSC，50 mmol/L 磷 酸 钠 ， 1 0 ％ 硫 酸 葡 聚 糖 （dextran sulfate，DS），0.1％ SDS和2 ng/L 探针DNA。 （2） 杂交液在沸水中变性 10 min，然后迅速冰 浴至少5 min。 （3）将杂交液滴加到染色体标本上（10 L/片）， 盖上盖玻片，置于37 ℃湿盒中杂交过夜。
接上步
（ 6 ） 加 2 L 0.2 mol/L EDTA pH8.0，2.5 L 4 mol/L LiCl，75 L 冰冷无水乙醇混 匀。 （7）－20 ℃沉淀2 h后，12000 rpm离心15 min。 （8）70%冷乙醇洗涤沉淀两遍。 （9）加入20 L TE溶解沉淀。
探针检测
实验目的
了解免疫荧光原位杂交的基本原理和 意义，掌握细胞免疫荧光原位杂交的 基本条件，方法和步骤。 熟悉染色体上核仁形成区的所在部位Fra Baidu bibliotek及特征，验证杂交位点与NORs的关系
实验原理
免疫荧光原位杂交的基本原理是基于免疫学研究 中抗原和抗体间的特异性反应与常规的荧光显微 镜镜检技术。在这种技术中，用于进行原位杂交 的DNA或RNA探针首先用结合有Bio（botin，生 物素）或Dig（digoxigenin，异羟基洋地黄毒甙） 的核甘酸类似物（Bio-11-dUTP，Bio-11UTP， Dig-11-dUTP，Dig-11-UTP）标记，然后使用结 合有荧光素分子的抗Bio 或抗Dig抗体或抗抗体处 理实施原位杂交后的细胞学制片。
接上步
（ 6 ）用含 50 mmol/L MgCl2 的 1 × PBS 洗涤玻片 5 min。 （7）用含50 mmol/L MgCl2和1％甲醛的1×PBS固 定标本5 min。 （8）2×SSC洗玻片2 min。 （9）在含70％去离子甲酰胺的2× SSC中 65 ℃处 理2 min。 （10）－20 ℃下70% 85% 100%乙醇系列脱水 各5 min后，室温下干燥。
探针标记及纯化 探针标记采用随机引物法标记
（1）纯化后的45SrDNA在沸水中变性10 min。 （2）将变性rDNA立即放至冰水中至少5min。 （3） 加 入 2 L 六 碱 基 随 机 引 物 ， 2 L dNTP （dATP，1mmol/L；dCTP，1mmol/L；dGTP， 1mmol/L；dTTP，0.65 mmol/L；DIG-11-dUTP， 0.35 mmol/L，pH 7.5）（Takara）。 （4） 加 入 Klenow 酶 2 U（Takara）， 加 水 补 足 2 0 L。 （5）37 ℃过夜标记20 h。