免疫电泳技术

免疫电泳技术

（一）原理

免疫电泳是琼脂平板电泳和双相免疫扩散两种方法的结合。将抗原样品在琼脂平板上先进行电泳，使其中的各种成分因电泳迁移率的不同而彼此分开，然后加入抗体做双相免疫扩散，把已分离的各抗原成分与抗体在琼脂中扩散而相遇，在二者比例适当的地方，形成肉眼可见的沉淀弧。

该方法可以用来研究：①抗原和抗体的相对应性；②测定样品的各成分以及它们的电泳迁移率；③根据蛋白质的电泳迁移率，免疫特性及其它特性，可以确定该复合物中含有某种蛋白质；④鉴定抗原或抗体的纯度。

（二）试剂与器材

同琼脂平板电泳。

（三）操作方法

1．在玻璃板的中央放置一小玻棒（d=2mm~3mm），然后用0.05mol/L pH8.6巴比妥缓

冲液配制1％琼脂，制成琼脂板，板厚2mm.。

2．在玻棒的两侧，板中央或1／3处，距玻棒4mm～8mm各打直径3mm～6mm的孔。

3．在孔内加满血清。

4．将玻璃板置电泳槽上进行电泳。电流为2mA/cm～3mA/cm（或电压3V/cm～6V/cm），

电泳时间4h～6h。

5．停止电泳，用小刀片在玻璃板两侧切开，取出玻璃棒，加抗血清样品。

6．于湿盒内37℃（或常温）扩散24h，取出观察。

7．于生理盐水中浸泡24h，中间换液数次，取出后，加0.05％氨基黑染色5min～10min，然后以1mol/L冰醋酸脱色至背景无色为止。

8．制膜、观察、保存标本。

（四）免疫电泳结果分析

1．常见的沉淀弧由于经电泳已分离的各抗原成分在琼脂中呈放射状扩散，而相应的抗体呈直线扩散，因此生成的沉淀一般多呈弧形，常见的弧形如下：①交叉弧：表示两个抗原成分的迁移率相近，但抗原性不同；②平行弧：表示两个不同的抗原成分，它们的迁移率相同，但扩散率不同；③加宽弧：一般是由于抗原过量所致；④分枝弧：一般是由于抗体过量；⑤沉淀线中间逐渐加宽并接近抗体槽，一般由于抗原过量，在白蛋白位置处形成；⑥其它还有弯曲弧、平坦弧、半弧等。

2．沉淀弧的曲度匀质性的物质具有明确的迁移率，能生成曲度较大的沉淀弧。反之有较宽迁移范围的物质，其沉淀弧曲度较小。

3．沉淀的清晰度沉淀线的清晰度与抗原抗体的特异性程度有关，也与抗体的来源有关。抗血清多来源于兔、羊、马。兔抗体的特点是形成沉淀线宽而淡，抗体过量对沉淀线影响较小，而抗原过量，沉淀线发生部分溶解。马抗血清所形成的沉淀线致密、清晰，抗原或抗体过量时，复合物沉淀溶解、消失，而且产生继发性的非特异性沉淀。因此使用抗原抗体时，一定要找好适当的比例。

4．沉淀弧的位置高分子量的物质扩散慢，所形成的沉淀线离抗原孔较近；而分子量较小的物质，扩散速度快，沉淀弧离抗体槽近一些。抗原浓度高沉淀弧偏近抗体槽，反之，抗体浓度过高，沉淀弧偏近抗原孔。

（五）注意事项

1．免疫电泳分析法的成功与否，主要取决于抗血清的质量。抗血清中必须含有足够的抗体，才能同被检样品中所有抗原物质生成沉淀反应。

2．抗血清虽然含有对所有抗原物质的相应抗体，但抗体效价有高有低，因此要适当考虑抗原孔径的大小和抗体槽的距离。

3．免疫电泳要求分析的物质一方为抗原，另一方为沉淀反应性抗体。因此没有抗原性的物质或抗原性差的物质、非沉淀反应性抗体，均不能用免疫电泳进行分析。