蛋白质测序

1蛋白质的N端测序

Edman降解法：Edman降解进行蛋白质与多肽序列分析是一个循环式的化学反应过程。包括三个主要的化学步骤：（1）偶联：异硫氰酸苯脂与蛋白质和多肽的N-端残基反应；（2）环化裂解：苯氨基硫甲酰酞（PTC-肽）环化裂解；（3）转化：噻唑呤酮苯氨（ATZ）转化为苯异硫尿氨基酸（PTH-氨基酸）；为了提高灵敏度，一是采用放射性同位素、荧光基团或有色Edman试剂, 二是采用更灵敏的鉴定手段, 如用微量薄层层析、气相色谱和高压液相色谱检出PTH氨基酸。蛋白质的液相测序仪、固相测序仪和气相测序仪的原理都是Edman 降解法。此法不能用于N端封闭的蛋白质的测序。

2蛋白质的C端测序

（1）羧肽酶法：羧肽酶法的原理就是通过检测羧肽酶逐个释放氨基酸的顺序来判断蛋白质的C端序列。其中释放氨基酸的检测有两种：（1）色谱法：直接检测所释放的氨基酸；（2）质谱法：通过测定蛋白质或多肽原分子量和释放一个氨基酸以后分子量的差值来推断所释放氨基酸种类，依次类推。羧肽酶法是近年来一种应用广泛的蛋白质及多肽C端测序方法。羧肽酶有4种，即: 羧肽酶A（CPA）、羧肽酶B（CPB）、羧肽酶Y（CPY）和羧肽酶P（CPP）。其中常用的是CPY和CPP。

（2）化学法：化学法指蛋白质或多肽与化学试剂反应后，专一性的裂解并检测C端氨基酸的方法。主要有(异) 硫氰酸法和过氟酸酐法。1、(异)硫氰酸法的原理：(异)硫氰酸法又称Schlack-Kumpf降解,该方法与Edman降解的原理类似.即化学试剂（异)硫氰酸）与蛋白或多肽的α-羧基反应，形成蛋白质或多肽乙内酰硫脲,再用裂解试剂切下C端残基,形成氨基酸乙内酰酸脲,然后利用HPLC系统分离分析游离的氨基酸乙内酰酸脲。由于不同氨基酸的乙内酰酸脲在HPLC上的保留时间不同，因此可以区分各种氨基酸。C端测序仪的原理即(异) 硫氰酸法。2、过氟酸酐法的原理：C端氨基酸残基的α-羧基与混合酸酐反应后，通过酮-

烯醇转换成氧氮杂环戊酮（恶唑酮），然后利用过氟酸或TFA，把这个环从C端截掉。然后反应依次连续进行。用质谱测定反应产物的分子量，通过相邻分子量的差值就可以得到其C端序列。

另外质谱法在蛋白质测序中发挥的作用越来越大。

Edman降解（Edmandegradation）：是测定蛋白质一级结构的方法，主要是从蛋白质或多肽氨基末端进行分析。由埃德曼（P．Edman）在上世纪50年代所创立。分为耦合、切割、萃取、转化、鉴定等几个步骤。首先在pH9．0的碱性环境下，将异硫氰酸苯酯(Ph—N=C=S，

PITC)和蛋白质或多肽N端氨基酸耦合，形成苯氨基硫甲酰(PTC)衍生物；然后以三氟乙酸(TFA)处理耦合后产物，将多肽或蛋白的N一端第一个肽键选择性的切断，释放出该氨基酸残基的噻唑啉酮苯胺衍生物：随后萃取出释放的氨基酸衍生物并在强酸性条件下转化为稳定的乙内酰苯硫脲氨基酸(PTH．氨基酸)；最后以色谱法鉴定出降解下来的PTH．氨基酸种类，从而得到蛋白质或多肽N端序列信息。Edman降解法的优点是异硫氰酸苯酯与所有氨基酸残基的反应产率和回收率都相当高，因此反应副产物少，用色谱可以准确鉴定。而且对大多数氨基酸残基而言，30 min的耦合反应时间、5 min的切割反应时间都已足够。

DNS法及聚酰胺薄膜层析技术测定蛋白质N—末端和蛋白质的氨基酸组成分析

原理：DNS—Cl在碱性环境里蛋白质和肽的α-氨基酸的氨基起反应，生成带有荧光的、稳定的DNS-氨基酸

蛋白质在水解前与DNS—Cl反应，产生DNS-蛋白质，它标记在N-末端氨基酸残基上，经水解和薄层层析而测知是何种氨基酸。蛋白质水解后与DNS—Cl反应，标记的是蛋白质的氨基酸组成成分，如图19-1和图19-2所示。这是一种较为简便的、适用的蛋白质的氨基酸组成成分分析的方法。（薄层层析：英文为thin layer chromatography 又称薄层色谱，色谱法中的一种，是快速分离和定性分析少量物质的一种重要实验技术，属固—液吸附色谱，兼备了柱色谱和纸色谱的优点，一方面适用于少量样品（几到几微克，甚至0.01微克）的分离；另一方面在制作薄层板时，把吸附层加厚加大，因此，又可用来精制样品，此法特别适用于挥发性较小或较高温度易发生变化而不能用气相色谱分析的质。是将吸附剂、载体或其他活性物质均匀涂铺在平面板（如玻璃板、塑料片、金属片等）上，形成薄层（常用厚度为0.25毫米左右）后，在此薄层上进行层析分离的分析方法。

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