荧光光度分析法测定维生素B2全

1. 激 发
通常在室温下物质分子 大部分处于基态的最低振动
能级（ =0）。当电子吸
收一定频率的电磁辐射发生 能级跃迁时，可上升至不同 激发态的各振动能级，其中 大部分分子上升至第一激发 单重态（ S1 ），这一过程 称为激发。
2.去活化过程
处于激发态的分子是不稳定，它可以通过 不同的途径回到基态，这一过程称为去活化。 去活化过程有以下几种：
5.溶 剂
许多有机物及金属的有机络合物，在乙醇 溶液中的荧光比在水溶液中强。乙醇、甘油、 丙酮、氯仿及苯都是常用的有机溶剂，其中大 多有荧光，应设法避免；一般避免的办法是稀 释，或加入一部分水。
6.荧光强度达到最高点所需要的时间不同，有 的反应加入试剂后荧光强度立即达到最高峰。有 的反应需要经过15~30分钟才能达到最高峰。
荧光分析法简述
指导教师：赵成国
一 、概 述 什么是荧光呢？当某些物质被光照射后，
它会吸收一定频率的光，而发射出波长更长的 光，当光停止时，发射光也随即消失，这就是 荧光现象，它发出的光就叫荧光。第一次发现 荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物 学家莫纳德斯 （N.Monardes）, 在一种木头 切片的水溶液中，看到了极为可爱的天蓝色， 以此开始了荧光研究。
4. pH的影响
带有酸性或碱性官能团的大多数芳香族化 合物的荧光一般都与溶液PH值有关，例如：在 pH=7~12的溶液中苯胺以分子形式存在，会发
出 蓝色荧光；而在pH<2或pH>13的溶液中苯胺以
离 子形式存在，都不会发出荧光。同时所用酸的种 类也影响荧光的强度，例如：奎宁在硫酸溶液中 的荧光比在盐酸中的要强。
（3）取代基的作用
给电子基增强荧光: －OH, －NH2,－NHR, －NR2,－C≡N
吸电子基减弱荧光：－Br , －Cl , － NO2, －N＝N, －COOH
五、影响荧光强度的因素
1.荧光的减退 荧光物质经紫外线长时间照射及空气的氧化
作用，会使荧光逐渐减退。
2.荧光强度与溶液浓度的关系
在稀溶液中： F＝Kc F 为荧光强度 K—检测效率（由仪器决定） c 为液体的浓度
三、荧光的特性
1.激发光谱和发射光谱 任何荧光化合物都有两个特征性光谱：激
发光谱和发射光谱 （1）激发光谱
绘制激发光谱时，固定荧光的最大发射波 长，然后改变激发光的波长，所测得的荧光强 度与激发波长的谱线关系即为激发光谱。
（2）发射光谱 发射光谱简称荧光光谱。绘制发射光谱
时，固定荧光的最大激发波长，然后改变发射 光的波长，所测得的荧光强度与发射波长的谱 线关系即为发射光谱。
（1）振动驰豫 溶液中分子间碰撞机会很 多，通过碰撞溶质分子将过剩的能量转移给溶 剂分子，通过非辐射跃迁而降至同一能态的最 低振动能级，这一过程称为振动驰豫。
（2）内部转换
同一多重态的不同电
子能级间可能发生内部转 换。 S2 S1或T2 T1
条件：当S2较低振动 能级与S1较高振动能级的 能量相当，且发生重叠时 分子才有可能S2 S1或 T2 T1
7.有机溶剂中常有产生荧光的杂质，可用蒸馏 法提纯。橡皮塞、软木塞及滤纸中也常有能溶于 溶剂的一些带荧光的物质。
六、荧光分析仪器的基本组成部件
包括有光源、单色器、样品池、检测器和 记录显示装置五个部分。
1. 激发光源
激发光源应具有足够的强度、适用波长范围 宽、稳定等特点。常用的光源有高压汞灯和氙弧 灯。
直到1852年在考察奎宁和叶绿素的荧光 时，用分光计观察到其荧光的波长比入射光的 波长稍长些，才判明这种现象是这些物质在吸 收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光 的漫射作用所引起的，才确立了荧光是光发射 的概念。到19世纪末人们已经知道了包括荧 光素、曙红、多环芳烃等600种以上的荧光物 质。
氙弧灯又称氙灯，是目前荧光分光分度计中 应用最广泛的一种光源。它是一种短弧气体放电 灯，外套为石英，内充氙气，光强度大氙灯的灯 内气压高，启动时的电压高（2040KV）,因此使 用时一定要注意安全。
（3）荧光发射 处于第一激发的
最低振动能级的分 子，跃迁回基态的 各振动能级，这一 过程称为荧光发射。
（4）体系间跨越跃迁
分子从激发单重态转至能量较低的激发三重 态的过程，称体系间跨越跃迁。
三重态：电子自旋方向相同
单重态: 电子自旋方向相反
这些分子从第一激发三重态的最低振动能级 下降至第一基态的各振动能级，所发出的辐射 即为磷光。
20世纪以来，荧光现象被研究得更多了， 发现了共振荧光、增感荧光，能够进行荧光 产率得绝对测定，还进行了荧光寿命的直接 测定等等。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
二、荧光发生机理
当一些物质被光照射后，物质的分子吸收光 以后，便以基态跃迁到激发态，成为激发分子， 然后通过相互碰撞或和其它溶剂分子碰撞等去 活化的过程而消耗了能量，回到第一激发态的 最低振动能级，这种跃迁称为无辐射跃迁，它 不会发光。当电子由激发态的最低振动能级跃 迁回基态的不同振动能级时，则以荧光的形态 发出能量。
— 吸收光谱 — 发射光谱
蒽的吸收光谱和发射光谱
四、荧光与分子结构的关系
（１）发光分子中要具有共轭π键体系 共轭的程度越大，π电子越容易激发，分子
放光越容易产生。
（2）具有刚性平面结构分子有利于荧光发射 分子的共平面越大，其π电子的共轭程度越大。
如荧光素和酚酞结构十分相似，荧光素有很强的 荧光，而酚酞没有，这是由于荧光素有刚性平面 结构，减少了分子振动，减少了去活化的概率。
高浓度时，荧光物质发生熄灭和自吸
收现象，使F与c不呈线性关系
F
c
3.温度的影响
温度对荧光强度的影响较敏感。溶液温度 下降时，介质的粘度增大，荧光物质与分子的 碰撞也随之减少，去活化过程也减少，则荧光 强度增加。相反，随着温度上升，荧光物质与 分子的碰撞频率增加，使去活化几率增加，则 荧光强度下降。
2.荧光光谱形状与激发波长无关
由于分子无论被激发到高于S1哪一个激发 态，都经过无辐射的振动驰豫或内部转换等过
程，最终回到S1态的最低振动能级，然后跃迁 回基态产生荧光。
3.吸收光谱和荧光光谱有很好的镜像关系
由于分子的S0态和S1态中各振动能级的能量分 布情况相似决定的。因此吸收光谱和发射光谱的形 状相似。