农杆菌介导水稻遗传转化的相关讨论

农杆菌介导水稻遗传转化相关的讨论

羧苄青霉素的作用

羧苄青霉素在农杆菌介导法对水稻进行遗传转化的过程中起到抑制农杆菌生长的作用。根据前人的研究经验，浓度为250mg/L时候抑制效果最好且不会影响愈伤组织的再生。本实验过程中我们发现，经过经验用量的羧苄青霉素抑制处理，转移至筛选培养基后一周左右即可见到少量愈伤农杆菌复发，有的甚至在第二次筛选时仍然生长出农杆菌，并未达到很好的抑制农杆菌生长的目的。这有可能是在长期的实验过程和进化过程中，农杆菌对苏氨苄青霉素产生了耐受性。因此，在遵循不影响愈伤组织生长的原则下，可以适当增加羧苄青霉素的用量，或者与头孢霉素配合使用，可以达到很好的抑制效果。

潮霉素作为筛选剂的最适宜浓度

本实验采用潮霉素基因作为筛选标记，经过长期经验积累，发现潮霉素浓度梯度25mg/L,35mg/L和45mg/L进行多轮筛选，假阳性最低，筛选效果最好，为最适筛选浓度。

各个阶段不同添加物的作用

水稻遗传转化过程中的碳源有多种选择，主要有葡糖糖，麦芽糖和蔗糖，糖类除作能源外,还可以作为渗透调节剂对愈伤组织的的质量起重要作用。根据转化受体的不同，碳源的种类和浓度也有区别。本实验室研究中发现，粳稻作为转化受体时，蔗糖为最佳的碳源，而在籼稻的遗传转化中，麦芽糖和蔗糖配合使用，效果最好。

植物激素是愈伤组织诱导和绿苗分化的关键性因素。2 ,4-D 的质量浓度至关重要,对于愈伤组织诱导来说,低浓度及高浓度的 2 ,4-D 都不适宜水稻成熟胚愈伤组织的诱导。在籼稻的遗传转化中，2 ,4 -D与6 -BA 配合使用更有利于愈伤组织的诱导及分化。

潮霉素和除草剂均可以作为筛选剂。适宜的筛选浓度有利有抗性愈伤组织的生长，潮霉素浓度过高，阳性愈伤组织也有可能被筛死，浓度过低，又会有较高的假阳性出现。实验证明，只用潮霉素筛选所得的抗性愈伤和先用潮霉素筛选后用除草剂筛选所得的抗性愈伤，在分化再生过程中有显著差异。前者分化出芽所

需时间较短，后者分化出的苗较健壮。

一定范围内，在共培养时添加较高浓度的乙酰丁香酮可提高转化频率, 当乙酰丁香酮浓度提高到300～400 u mo l/L 时, 转化频率明显高于较低浓度乙酰丁香酮的转化率。