分子克隆3—DNA凝胶电泳和脉冲场琼脂糖凝胶电泳

方案1.琼脂糖凝胶电泳

方案2.琼脂糖凝胶中DNA的检测

方案3.琼脂糖凝胶中DNA的回收：DEAE-纤维素膜电泳

方案4.琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺中DNA的回收：电泳洗脱至透析袋方案5.阴离子交换色谱纯化从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶回收的DNA 方案6.低熔点琼脂糖凝胶中DNA的回收：有机溶剂抽提

·替代方案：用玻璃珠从琼脂糖凝胶中回收DNA

方案7.低熔点琼脂糖凝胶中DNA：用琼脂糖酶消化

方案8.碱性琼脂糖凝胶电泳

·附加方案：碱性琼脂糖凝胶的放射自显影

方案9.中性聚丙烯酰胺凝胶电泳

方案10.聚丙烯酰胺凝胶中DNA的染色检测

方案11.聚丙烯酰胺凝胶中DNA的放射自显影检测

方案12.聚丙烯酰胺凝胶中DNA片段的回收：压碎与浸泡法

脉冲场凝胶电泳（方案13~20）

方案13.脉冲场凝胶电泳制备DNA：哺乳动物细胞和组织DNA的分离方案14.脉冲场凝胶电泳制备DNA：酵母完整DNA的分离

方案15.琼脂糖凝胶中DNA的限制性内切核酸酶消化

方案16.脉冲场凝胶电泳的分子质量标准

方案17.横向交变场的脉冲场凝胶电泳

方案18.箝位匀强电场的脉冲场凝胶电泳

方案19.脉冲场凝胶中DNA片段的直接回收

方案20.脉冲场凝胶中浓缩DNA片段的回收

琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳用于分离、鉴定和纯化DNA片段。该技术的优点：

[1].操作简单而迅速，能分离用其他方法不能满意分离的片段；

[2].凝胶DNA的位置可以用低浓度荧光插入染料直接观察到

[3].这些分离的DNA条带可以从凝胶中回收，用于各种目的。

[4].琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶能灌制成各种形状、大小、孔径，也能以许多不同的构型

和方位进行电泳。这些参数或条件的选择主要取决于被分离DNA片段的大小。

A.聚丙烯酰胺凝胶：

[1].适用范围：

1.)最适合分离小片段DNA（5~500bp）；

2.)聚丙烯酰胺凝胶电泳是在恒定电场中垂直方位上进行的。

[2].优点：

1.)聚丙烯酰胺凝胶分辨率非常强，长度上相差1bp或质量上相差0.1%的DNA都可

以彼此分离。

2.)可以很快进行电泳，容纳较大的DNA上样量；

[3].缺点：

1.)在制备和操作上更繁琐；

B.琼脂糖凝胶：

[1].适用范围：

1.)分辨率略低，但分离范围更大（50bp~百万bp）；

2.)小片段DNA(50~20 000bp)最适合在恒定强度和方向的电场中水平位的琼脂糖凝胶

内电泳分离。在这些条件下，DNA泳动速率通常随DNA片段长度的增加而减少，

但与电场强度成正比。当线状双螺旋DNA的半径超过凝胶的孔径时就达到凝胶分

辨率的极限，上述相关性立即被破坏，此时，DNA不再被凝胶按其大小筛分，而

必须以一段在前的方式在介质中迁移，这种迁移模式称为“蠕行”（reptation）。

3.)脉冲场电泳(pulsed-field gel electrophoresis, PFGE)：应用交替变换的方向成直角的

两个电场于凝胶，可以分辨的DNA长度已超过6000kb。对于所有生物体，PFGE

通常用于研究基因组、克隆和分析大的基因片段。

[2].优点：

[3].缺点：

1.)凝胶的孔径越大，能被分离的DNA就越大，用低浓度琼脂糖(0.1%~0.2%, m/V)灌

制的凝胶可以分辨很大的DNA分子，但是这样的凝胶很脆，容易碎裂，并且需要

几天的时间电泳。即便如此，也不能分辨大于750kb的线状DNA分子。

方案1.琼脂糖凝胶电泳

琼脂糖是D-和L-半乳糖残基通过α(1→3)和β(1→4)糖苷键交替构成的线状聚合物。

琼脂糖形成螺旋纤维，后者再聚合成半径20~30nm的超螺旋结构。琼脂糖凝胶可以构成一个直径从50nm到略大于200nm的三维筛孔的通道。

商品化的琼脂糖聚合物每个链约含有800个半乳糖残基，琼脂糖不是均一的，不同制造商或不同生产批次的多糖链的平均长度都是不同的。此外，较低等级的琼脂糖也许存在其他多糖、盐和蛋白质的污染。这种变异性（非均一行）影响琼脂糖凝结和融化的温度、DNA的筛分和从凝胶回收DNA作为酶切底物的能力。应用特制等级的琼脂糖可以减少以上潜在的问题。

A.决定DNA在琼脂糖凝胶中的迁移速率的因素：

[1].DNA 分子的大小：双链DNA分子在凝胶基质迁移的速率与其碱基对数的常用

对数成反比。分子越大，迁移的越慢，因为摩擦阻力越大，也因为大分子通过凝胶孔径的效率低于较小的分子。

[2].DNA的构象：超螺旋环状(I型)、切口环状(II型)、线状(III型)DNA在琼脂糖凝

胶中以不同速率迁移。上述三种类型的相对迁移率主要取决于琼脂糖凝胶的浓度和类型，但是电流强度、缓冲液离子强度和I型超螺旋绞尽的程度和类型也影响相对迁移率。绝大多数情况下，区分不同构象DNA的需求很简单，主要是区分未处理的环状DNA样品和单一位点经限制酶作用线状化的同一DNA样品。[3].琼脂糖种类：常见的琼脂糖主要有2种：标准琼脂糖和低熔点琼脂糖（主要用于

DNA的快速回收）。

在琼脂糖凝胶电泳中，核酸向阳极迁移的速度受到电内渗(EEO)。电内渗是由于离子化的酸性基团（通常是硫酸盐）附着到琼脂糖凝胶的多糖基质引起的。酸性基团导致缓冲液中产生正电荷反向离子，它们向阴极迁移，从而造成与DNA反方向迁移的液流。琼脂糖中负电荷密度越高，EEO流越大，并且核酸片段的分离越差。

[4].琼脂糖浓度：在DNA电泳迁移率(μ)数和凝胶浓度(ι)存在线状相关，这种相关性

可以用方程式来表示：

lg μ = lg μ。—Kr ι

其中μ。是DNA自由电泳迁移率；Kr是阻滞系数，是一个与凝胶性质、迁移分子大小和形状相关的常数。

[5].所用的电压：低电压时，DNA片段迁移率与所用的电压成正比。电场强度升高时，

高分子质量片段的迁移率遂不成比例的增加。当电压增大时琼脂糖凝胶分离的有效范围反而减少。要获得>2kbDNA片段的良好分辨率，则所用电压不应高于5~8V/cm。

[6].电泳缓冲液：DNA的泳动受电泳缓冲液的组成和离子强度的影响。缺乏离子则电

导率降至很低，DNA不是全然不动，就是迁移极慢。高离子强度时，电导率升高，会产生大量的热能，最严重时凝胶会融化，DNA会变性。

B.电泳缓冲液：

有几种缓冲液适用于天然双链DNA的电泳：Tris-乙酸盐和EDTA缓冲液 (pH 8.0, TAE，也称作E缓冲液)、Tris-硼酸盐缓冲液（TBE）、Tris-磷酸盐缓冲液（TPE），工作浓度约50mmol/L, 工作pH 7.5~7.8。各种电泳缓冲液通常配制成浓溶液，室温存放。

这种缓冲液都工作的很好，选择哪一种使用主要看个人工作习惯。

[1].三者之中，TAE的缓冲容量最低，如长时间电泳会被消耗，此时，凝胶的阳极一

侧将发生酸性化，凝胶中向阳极迁移的溴酚蓝的颜色呈从蓝紫色到黄色的变化。

该颜色变化从pH4.6开始，到pH3.0结束。所以应该定期更换缓冲液或调换2个电极池的缓冲液可以防止TAE的消耗。

[2].TBE 和TPE比TAE花费稍贵些，但是它们有高得多的缓冲容量。

[3].双链线状DNA片段在TAE中比在TBE或TPE中迁移快10%。

[4].对于高分子质量DNA，TAE的分辨率略高于TBE或TPE，对于低分子量DNA，TAE

要差些。

[5].超螺旋DNA在TAE中的电泳分辨率要好于TBE。

C.凝胶载样缓冲液：