用CRISPR Cas9方案构建双基因敲除鼠, 获得双基因敲除纯合子小鼠的交配方案

双基因敲除小鼠繁殖工作：

CRISPR/Cas9方案构建双基因敲除鼠，得到F0杂合子之后，如何建系才能获

得双基因敲除纯合子小鼠？这是经常被问到的问题，下面就简单回答一下。

假设我们的目的基因为A和B，通常用CRISPR/Cas9方法得到的基因敲除鼠

为杂合子，双杂合子小鼠基因型为AaBb，大写字母代表野生型（dominant），小写字母代表突变型（recessive）。得到F0杂合子（AaBb）之后，可以用

以下方案之一来获得双基因敲除纯合子小鼠：

方案一：

1.将双杂合子小鼠（AaBb）与野生鼠（AABB）交配，理论上将得到25%的

野生型（AABB），25%基因A单杂合子（AaBB）,25%基因B单杂合子

（AABb）及25%双杂合子小鼠（AaBb）。

2.将所得到的双杂合子小鼠（AaBb）互交（inter-cross），理论上6.25%

的后代将会是双基因敲除纯合子小鼠（aabb），见下图。

3.由于双基因敲除实验中一般都需要单基因敲除动物作为对照，所以在

进行上面小鼠breeding的同时可以将基因A单杂合子（AaBB）互交，

在后代中鉴定出基因A纯合子（aaBB）,同样将基因B单杂合子（AABb）互交，在后代中鉴定出基因B纯合子（AAbb）。

方案二：

将双杂合子小鼠（AaBb）与单基因纯合子（如aaBB）交配，所生小鼠

中约25%为基因A纯合子而基因B杂合子（aaBb,见下图左）。然后将

aaBb小鼠互交，理论上后代小鼠中25%为双基因敲除纯合子小鼠

（aabb），见下图右。

需要特别注意的几个问题：

1)上面所讲的方法适用于位于不同的染色体两个基因的基因敲除，如

果两个基因位于同一条染色体上，要通过上述方法得到双基因敲除

纯合子小鼠很难；

2)上述方法有赖于基因特异性的Genotyping PCR assays。在开始set

up breeding之前必须将两个目的基因特异性的Genotyping PCR

assays 准备好；

3)要事先研究一下目的基因敲除后有无胚胎致死性，是否影响其生长

发育等。当然单基因敲除无胚胎致死性并不表示双基因敲除无胚胎

致死性。