中药质量标准的研究现状及展望

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HPLC（高效液相色谱法）——定性、定量
薄层鉴别品种的数量
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药材和单列 炮制品 植物油脂 和提取物
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339 15
种类
2005版
2010版 490 35
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加权增幅 （%） 30 54
薄层色谱法几乎成了中药材和中成药的 首选鉴别方法
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1
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2 3 4 5 6 7
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液相色谱-质谱联用技术 液相色谱：分离物质
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质谱检测器：将分子电离成离子，将不同 质荷比的离子分开后检测。
ESI离子化源 四极杆质量分析器
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源自文库
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液相色谱-质谱联用技术 ESI离子化源
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液相色谱-质谱联用技术 四极杆质量分析器
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中药饮片标准缺乏
中药制剂品种被药典收载的比例小
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部分中药制剂中的处方用药无药典标准
（2）增加的情况：
中药材：增加65种（包括单列饮片3种：姜半 夏、清半夏、茯苓皮） 中药饮片：增加439种 中药提取物：增加16种 中药成方制剂：增加499种
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注：新增中药制剂中05版药典未收载的中药材
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9 10 11 12 13 14 15
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1：人参皂苷Rb1 2：人参皂苷Re 3：人参皂苷Rf 4：人参皂苷Rg1 5：人参1 2μl 6：人参1 5μl 7：芦头3 2μl 8：芦头3 5μl
简便、快速、直 观；同时多样本分 析
9：双百口服液2μl +人参皂苷Rb1、Re、Rf、Rg1各2μl 10：双百口服液2μl 11：双百口服液5μl 12：双百口服液2μl+黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各2μl 13：黄芪药材溶液2μl 14：黄芪药材溶液5μl 15：黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ各2μl
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川楝素 m/z 573.2
液相色谱-质谱联用技术 液相色谱-质谱联用技术特点
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灵敏度高 选择性好
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利用薄层-生物自显影技术的品种
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地黄 熟地黄
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地黄
【鉴别】 （3）取本品粗粉1g，加80%甲醇50 ml，超声处理30分 钟，滤过，滤液蒸干，加水5 ml使溶解，用水饱和的正丁醇 振摇提取4次，每次10 ml，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇2 ml 使溶解，作为供试品溶液。另取麦角甾苷对照品，加甲醇 制成每1 ml含1 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法 （附录Ⅵ B）试验，吸取供试品溶液5 μl、对照品溶液2 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲醇-甲酸 （16:0.5:2）为展开剂，展开，取出，晾干。再用0.1%的2 ，2-二苯基-1-苦肼基无水乙醇溶液浸渍，晾干。供试品色 谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点 。
国家标准 《中国药典》 部、局颁标准 地方标准：
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法定标准
省、自治区、直辖市中药材药品标 准、中药饮片炮制规范
企业标准： 内控标准、可高于法定标准
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增加收载品种 明确饮片标准 提高质量标准 注重环境保护
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应用现代分析方法
1、增加收载品种
（1）增加的原因：
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内容
中药质量标准
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发展历史
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标准现状 未来展望
最早的中药技术标准
《神农本草经》后汉，收载365种中药； 《本草经集注》南北朝，增加产地、采集时间及加工方法； 《新修本草》唐代，世界上最早的国家药典
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最早的中药制剂技术标准
《太平惠民合剂局方》宋代：对处方、剂型、制剂工艺、 用法用量、功能主治作了详细解释。
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利用液相色谱-质谱联用技术的品种：
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川楝子 苦楝皮
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川楝子
【含量测定】 照高效液相色谱-质谱法测定。 色谱、质谱条件及系统适应性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以乙腈-0.01%甲酸溶液（31: 69）为流动相；采用单级四极杆质谱检测器， 电喷雾离子化(ESI)负离子模式下选择m/z 573.2离子进行检测。理论板数按 川楝素峰计算应不低于8000。 对照品溶液的制备 取川楝素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1ml 含2µg的溶液，即得。 供试品溶液的制备 取本品中粉约0.25g，精密称定，置具塞锥形瓶中， 精密加入甲醇50ml，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲 醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液2μl与供试品溶液1～2μl，注入液相色 谱-质谱联用仪，测定，以川楝素两个峰面积之和计算，即得。 本品按干燥品计算，含川楝素（C30H38O11）应为0.060％～0.20％。
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最早的中药材技术标准
《本草品汇精要》明代：收载中药材1815中，对其名、 苗、地、时、收、用、质、色、味、气等24方面予以描 述。
中国药典版本 2010 1995 2005 1990 2000 1985 1977 1963 1953
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化学鉴别 显微鉴别
性状鉴别
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后，结果会自动消失。
利用DNA分子鉴定技术的品 种：
乌梢蛇、蕲蛇
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不同批次乌梢蛇药材DNA鉴别结果
乌梢蛇及其混淆品的DNA鉴别结果
乌梢蛇
【鉴别】 聚合酶链式反应法。 模板DNA提取 取本品粉末约0.5g，液氮中充分研磨使成粉末，取适量（约0.1g）至 1.5mL离心管中，加入275μl消化液（细胞核裂解液200 μl，0.5M EDTA 50μl，蛋白 酶K（20mg/ml）20μl，RNA酶溶液 5μl），55℃温育1小时，入250μl Wizard SV Lysis Buffer混匀，加到柱中，10000r/min离心3分钟；弃掉过滤液，加入800μl洗脱液 （醋酸钾162.8mM，Tris-HCl 22.6mM（pH7.5），EDTA 0.019mM（pH8.0），60% 乙 醇），10000r/min离心1分钟；弃掉过滤液，用洗脱液反复洗脱3次，每次10000r/min 离心1分钟；弃掉最后一次过滤液后再离心2分钟，将过滤柱转移入新的离心管中，加 入100μl无菌双蒸水，室温放置2分钟后，10000r/min离心2分钟，滤液-20℃保存备用 。取对照药材粉末约0.5g，同法制成对照药材模板DNA溶液。. PCR 反 应 鉴 别 引 物 ： 5’GCGAAAGCTCGACCTAGCAAGGGGACCACA3’ 和 5’CAGGCTCCTCTAGGTTGTTATGGGGTACCG3’。PCR反应体系：25μl反应体系包 括10×PCR缓冲液2.5μl，dNTP（2.5mM）2μl，鉴别引物（10μM）各0.5μl，高保 真TaqDNA聚合酶（5U. /μl）0.2μl，模板0.5μl，无菌双蒸水19.3μl。PCR反应参数 ：95℃预变性5分钟后，进行30次循环（95℃ 30秒，63℃ 45秒），后延伸72℃ 5分钟 。 电泳检测 用琼脂糖凝胶电泳法，胶浓度为1％，胶中加入核酸凝胶染色剂GelRed；供 试品与对照药材鉴别PCR产物的上样量分别为8μl，DNA分子量标记上样量为2μl（ 0.5μg. /μl）。电泳结束后，凝胶在凝胶成像仪上或紫外透射仪上观察，供试品与对 照药材凝胶电泳图谱在300-400bp之间应有单一条带。
抗氧化作用的评价
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采用薄层色谱视频模拟扫描软 件，通过测算各药材活性斑点 总峰面积的大小，用以比较不 同产地或批次的药材样品的抗 氧化能力，总峰面积越大，抗 氧化能力越强。
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利用 TL C生物自显影对具有胆碱酶 抑制活性的化合物进行筛选。
乙酰胆碱脂酶抑制剂的生物活性测定原理: 以 硫 代 乙 酰 胆 碱 为 底 物 ， DTNB [5, 5’-dithiobis-(2nitrobenzoic acid)]为染料。将底物、染料及酶依次徐布 在吸附了待测化合物的薄层板上，底物在乙酰胆碱脂酶 存在下发生水解反应，水解产生的硫代胆碱与染料 DTNB进一步发生反应，形成黄色化合物5-巯基-2-硝基 苯甲酸盐(5-thio-2-nitrobenzoate)。在薄层板上，有活性 化合物存在的部分由于活性化合物对乙酰胆碱脂酶的抑 制作用，以上化学反应无法进行而呈现白色斑点。该反 应现象一般应在15min以内观察完毕，因为20 -30 min以
厚朴
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厚朴酚 和厚朴酚
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摘自：谷丽华, 王峥涛等. 应用薄层色谱-生物自显影技术评价乌药等 三种中药的抗氧化活性，药学学报，2006, 41(10)：956-962
紫苏子
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芹菜素 木犀草素
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摘自：谷丽华, 王峥涛等. 应用薄层色谱-生物自显影技术评价乌药等 三种中药的抗氧化活性，药学学报，2006, 41(10)：956-962
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4、提高质量标准
（1）专属性鉴别的应用
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基本取消化学反应和光谱鉴别方法 大幅增加横切面或粉末显微鉴别 大量使用专属性较强的薄层色谱 （TLC）鉴别技术
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合计新增1019个
增修订标准的数量汇总表
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注：摘自药典委员会的统计数据
2、明确饮片标准
（1）收载方式：
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单列质量标准 (23种)
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置于中药材项下列出质量标准
实例：
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（2）饮片的定义 凡例第十三条：饮片系指药材经过炮制后 可直接用于中医临床或制剂生产使用的处 方药品。
HPLC（UV）含量测定品种的数量
种类
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药材和单列 炮制品 植物油脂 和提取物
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165 8
2005版
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2010版 298 26 加权增幅 （%） 62 114
（2）新分析方法的应用
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液相色谱-质谱联用技术 (LC-MS)
薄层-生物自显影技术 (TLC-Bioautography) DNA分子鉴定技术
用途：用于具抗氧化活性中药的质量评价 原理： DPPH是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若被 测物能清除它，则提示被测物具有抗氧化活性。 DPPH 本身显紫色，具有清除DPPH 自由基能力的物质能使其还 原成DPPH-H 而呈现黄色。
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摘自：谷丽华, 王峥涛等. 应用薄层色谱-生物自显影技术评价乌药等 三种中药的抗氧化活性，药学学报，2006, 41(10)：956-962
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TLC-生物自显影技术 定义：
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将薄层色谱分离和生物活性测定相结 合的方法，可以用于物质的活性筛选 和中药质量评价。
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生物活性包括： 抗菌/真菌、抑制胆碱酶以及抗氧化等
以2，2-二苯基-1-苦肼基（DPPH）无水乙醇 溶液为显色剂的TLC-生物自显影技术介绍
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苦楝皮
【含量测定】 照高效液相色谱-质谱法（附录Ⅵ D）测定。 色谱、质谱条件与系统适应性实验 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂； 以乙腈- 0.01% 甲酸溶液（31: 69）为流动相；采用单级四极杆质谱检测器， 电喷雾离子化(ESI)正离子模式下选择m/z 573.2离子进行检测。理论板数按 川楝素峰计算应不低于8000。 对照品溶液的制备 取川楝素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 ml 含1µg的溶液。即得。 供试品溶液制备 取本品粉末（过四号筛）约0.25 g，精密称定，置圆底 烧瓶中，精密加入甲醇50 m1，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重 量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 测定法 分别精密吸取对照品溶液2 μl和供试品溶液1~2 μl注入液相色谱质谱联用仪，测定，以川楝素两个峰面积之和计算，即得。 本品按干燥品计算，含川楝素 (C30H38O11）应为0.010%～0.20%。
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凡例第三十一条：制剂处方中的药味，均 指饮片，需经炒、蒸、煮等或加辅料炮炙 的，处方中用炮制品名； 同一饮片炮炙方 法含两种以上的，采用在饮片名称后加注 “制”来表述。… … 明确：配方和制剂只能使用饮片
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3、应用现代分析方法
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（1）目前中药质量控制的常用分析方法 TLC（薄层色谱法）——鉴别