土壤真菌分离计数

兼用于土壤真菌的分离和计数：孟加拉红琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基(PDA)、麦芽浸汁琼脂培养基(MEA)和牛胆汁琼脂培养

孟加拉红琼脂培养基是一种组合培养基，成分准确，其上发育的真菌数量及种类较多，放线菌及大部分细菌易被孟加拉红和链霉素所抑制，但真菌菌落较小，是最常用的土壤真菌分离和计数培养基。然而由于孟加拉红琼脂培养基对真菌菌落和繁殖器官形成的限制，以及染料影响在原始平皿上正常识别某些真菌，与酸性培养基相比，必须转移更多的菌落到其它的培养基上。

PDA和MEA均为酸化的天然培养基，能抑制全部细菌和放线菌。但由于酸度过高。有些耐酸性较弱的真菌，在其上不能发育，因此出现的数量及种类都比孟加拉红琼脂培养基上低。

牛胆汁琼脂培养基上菌落发育不大，放线菌和细菌也全部被抑制，数量准确，但由于结晶紫的影响，不易在培养基上直接鉴定。

土壤真菌常用的分离方法：

1、稀释法

此种方法在土壤真菌分离中最常用，用无菌水将土壤稀释后得到10-3～10-4的悬浮液，将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上，菌落长成后，将单个菌落挑出、培养、鉴定。

这种方法对土壤中产孢量大的半知菌、子囊菌和接合菌，如青霉属Penicillium，曲霉属Aspergillus和毛霉属Mucor等有利，所分离到的主要是以孢子形态存在于土壤的真菌，以菌丝体形式存在的则较难分离到。这种方法分离的真菌并不能代表土壤中真菌的真实存在情况，因为部分真菌的孢子和菌丝经常附着在土壤颗粒上，没有被充分洗脱下来，因而也就无法继续培养，这样有可能丢失了很大部分真菌。

2、土壤平板法

将一定量土壤(一般1.5~5 mg)移入灭菌的培养皿中，涂平，然后倒入冷却至45℃的培养基，摇匀后培养；或将土壤直接加在冷却后的培养基表面培养。

稀释法分离过程中，附着在矿物粒子或埋藏在腐殖质内的真菌不易分离到，此种方法可较全面获得土壤中的真菌，除了以休眠孢子存在的真菌还可以分离以菌丝存在的真菌。若土壤中存在腐霉（Pythium）、木霉（Trichoderma）或毛霉（Mucor）等真菌，由于生长过快，会很快覆盖培养皿而不易分离得到其他生长相对慢的真菌，因此该方法对生长较快的真菌有利。

3、菌丝分离法

一定量土壤充分冲洗后，过孔径50μm的筛，残留筛上的土粒置于培养皿中，体视镜下观察，将黏附于土粒上的菌丝或菌丝块取出，置于培养皿中，然后倒入培养基培养，将生长的新菌丝顶端切下后再培养，这种方法分离的真菌一般都是前两种方法未分离到的。

该方法对以下真菌的分离有利：菌丝较粗；不易断裂；颜色较深。但这种方法获得的分离物在培养过程中，经常作为不育菌丝的形态存在，难以产孢，因此无法鉴定，而且费时、费力，不是很常用。

4、诱饵法

这是一种生物学的方法，适合于从土壤中分离数量较少的特定真菌，即将“诱饵”埋入土壤一段时间，取出后直接培养以此获得所需要的真菌。分离的真菌不同，所选用的诱饵也不同，如大麻种子就是分离水生菌以及腐霉属Pythium很好的诱饵；而凤梨的茎和叶子能够诱集Phytophythora cinnamomi；胡萝卜的圆片可以诱集Thielaviopsis basicola；土豆的块茎诱集Phytophthora infestans；喜角质的壶菌常用的诱饵为人的毛发。

5、其他的分离方法

孢子悬浮法：最初用来分离长蠕孢属Helmithosporium，也适于分离其他以孢子状态存在土壤的真菌。

干燥法：通过将土样用氯化钙干燥后，进行分离。该种方法分离获得的是在土壤中以孢子状态存在的真菌，而以菌丝状态存在的真菌则因为干燥失水死亡。

埋管法和Rossi-Cholodny埋片法：这两种方法中，生长旺盛、对低氧忍耐较强的真菌比较容易分离到，较易分离以活跃菌丝存在的种类，如立枯丝核菌Rhizocotoniasolani。

土壤真菌计数法

直接计数法培养后测定菌落数【稀释平板法、土粒法以及最大概率数值法】

间接计数法土壤真菌染色后在显微镜下计数【Rossi-Cholodny埋片法、Jones-Mollison 法、Thornton-Gray (Ratio)法、土壤切片法、荧光抗体法以及电子显微镜直接观察法、荧光显微镜观察法等】

直接计数法

稀释平板法

根据土壤中真菌的数量，一般采用的稀释度为10-1~10-3，同时称取待测土样10g左右，经105℃烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，计算土壤含水量的百分数。用混菌法和刮刀法将土壤悬液接种在培养皿中，重复4次，于28~30℃恒温箱中培养5~7d，选取菌落数在10~100的培养皿进行计数(剔除扩散性真菌菌落占据琼脂表面15%的培养皿)。

最大概率数值法

以烟草黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsis basicola)为例，取烘箱干燥土样10g。用每毫升含60μg金霉素的灭菌蒸镏水配制每级10倍的稀释液至10-5或10-6。在铺有滤纸的培养皿内放3片10mm厚的胡萝卜片，用直径23mm的打孔器在上面打出一凹穴，加入稀释液1mL，重复3次。接种6~7d，记录发病胡萝卜饼数目。若2~6次稀释度中获得阳性结果(5，4，2，0，0)。以p1为5，p2为4，p3为2的值，查表得近似值2.2。

土粒法

对于不产孢子的真菌，采用将土粒接种在选择性培养基上的方法来分离计数。取少量土样加无菌水调成糊状，用圆头玻璃棒在平板上点样，适温下培养一定时间后，观察生长情况，结果以百分数表示。此方法只能得到不同土壤之间同类真菌数量的比较粗略的数据。

间接计数法

Rossi-Cholodny埋片法

将载玻片埋在土壤中，经过一定时间后镜检测定载玻片表面生长的微生物的半定量方法。真菌一般放大400~600倍，每枚标本片观察100~400个视野，以检出真菌的视野数与总视野数之比表示生育量(检出频率%)。此方法适用于测定不同时期不同土壤中真菌菌丝体丰度，然而不能测定每单位重量土壤的菌数(生育量)。

毛细管法

根据微生物利用土壤本身的毛细管系统输送的空气和养分而生存的原理。将灭菌的毛细管插入融化的0.2%琼脂中，然后安装在支架上，插入土壤中，一定时间后取出，用5%碳酸赤藓红染色，在显微镜下观察。此方法能显示出天然生境下的微生物区系，并分离出许多未能为平板法所揭示的微生物种，但得不出单位重量土壤中所含真菌数量。不过，反映出的数量仍可作为不同土壤之间的相对比较。

Jones-Mollison法