土壤真菌分离计数
土壤微生物的分离与平板菌落计数
土壤微生物的分离与平板菌落计数实验二土壤微生物的分离与平板菌落计数一、实验目的(1)几种常用分离纯化微生物的基本操作技术(2)掌握倒平板(3)学习平板菌落计数的基本原理和方法二.实验原理微生物的分离与纯化是指从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程。
分离纯化微生物的常用方法有平板表面画线法、平板表面涂布法和琼脂培养基浇注法等，因为其方法简单、设备简单、分离效果好，所以一直被实验室普遍选用。
活菌计数的基本方法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落。
统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。
三.实验器材1.材料:土壤2.培养基:牛肉膏蛋白胨培养基3.仪器或其他用具:无菌培养皿，盛有9ml无菌水的试管，1ml移液器，玻璃涂布器，恒温培养箱四.实验步骤(一)采样取表层以下5-10cm处的土样，放入灭菌的袋中备用，或放在4 ?冰箱中暂存。
(二)倒平板(无菌操作)培养基加热溶化，待冷至55-60? ，然后在无菌操作条件下倒入培养基于无菌培养皿中，并在各培养皿上作好标记。
(三)制备土壤稀释液(无菌操作)1.制备土壤悬液用电子天平称取 5g土于装有45ml无菌水的三角瓶中，振摇约20min,使土壤与水充分混匀2.梯度稀释取1ml土壤悬液加入装有9ml无菌水的试管，以此类推制成10-1 、10-2、10-3等不同稀释度的土壤溶液。
(四)平板分离单菌落(无菌操作)选用平整、圆滑的接种环，按无菌操作法挑取少量含菌的土壤悬液，在酒精灯旁进行划线操作，用左手控制培养皿，右手捏接种环，在标记处划3-4条连续的平行线作当作初步稀释的菌源。
烧去接种环上的残余菌样。
将烧去残余菌样后的接种环在平板培养基边缘冷却以下，然后将培养基另一区转至划线位置，将接种环通过菌源区而移至现在的划线区，依次类推划上几次。
土壤真菌分离实验报告
一、实验目的1. 掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法，从而获得真菌纯培养技能。
2. 了解基本接种技术。
3. 建立严格的无菌操作概念，掌握无菌操作技术。
二、实验原理土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。
真菌在土壤中的数量仅次于细菌和放线菌，主要在有机质丰富、透气性好的偏酸性土壤中较多。
分离土壤中的真菌并不难，但由于其菌落大，容易扩展，技术准确性较低。
本实验采用加有链霉素（或氯霉素、庆大霉素）和孟加拉红的马丁氏培养基分离及计数土壤中的真菌。
在此培养基上，放线菌和细菌被链霉素和孟加拉红所抑制，但大多数真菌能够生存，且其菌落受孟加拉红的抑制而较小，从而避免了某些真菌的扩散蔓延而带来的数量上的误差。
三、实验器材和材料1. 器材：台秤、电子秤、烧杯、试管、三角瓶、量筒、酒精灯、移液管、移液枪、1mL无菌吸管、无菌培养皿、接种环。
2. 材料：新鲜土样、无菌水、马丁-孟加拉红培养基。
四、实验方法与步骤1. 培养基的制备- 配方：葡萄糖10.0g、蛋白胨5.0g、琼脂 20g、K2HPO4 1.0g、MgSO4 ·72O 0.5g、1/3000孟加拉红水溶液100mL、0.03链霉素稀释液100mL、自来水800mL。
- 将上述成分称量后，加入适量的蒸馏水，加热溶解，待冷却后加入孟加拉红水溶液和链霉素稀释液，混匀后分装于试管或三角瓶中，高压灭菌。
2. 土壤稀释液的制备- 称取10g新鲜土样放入盛有90mL无菌水的烧杯中，充分搅拌均匀。
- 将上述土壤菌液和4支装有9mL无菌水的试管排列好，依次编号为10-1、10-2、10-3、10-4及10-5。
- 在无菌操作条件下，用1mL无菌移液管吸取1mL 10-1浓度的菌液于一管9mL 无菌水中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓度菌液。
同样方法，依次稀释到10-5。
3. 接种- 将制备好的马丁-孟加拉红培养基倒入无菌培养皿中，待凝固后，用无菌接种环挑取适量土壤稀释液，涂布于培养基表面。
土壤微生物分离纯化及测数.
土壤微生物别离纯化及测数土壤微生物|别离纯化及测数来源：生物秀时间：2021-5-28一、实验目的要求了解土壤微生物的别离纯化及测数的根本原理。
学习并掌握微生物别离纯化技术方法。
学习并掌握微生物平板菌落计数的技术方法。
二、根本原理土壤是微生物生活的大本营，其中含有大量不同类型的微生物，可按照一定的方法将各类微生物通过别离进行纯培养，并能对特定类群进行数量测定。
根本原理是通过稀释使菌体细胞充分分散，单细胞得以生长发育形成菌落，可使用稀释法或平板划线法进一步纯化，还可通过平板菌落计数，推算单位重量土壤样品含有微生物的数量。
三、实验步骤〔一〕土壤样品采集在待测田块上，假设田块面积小于50平方米那么按对角线三点采样，假设田块面积大于50平方米按对角线五点采样。
采样一般定点于耕作层0--20cm，先除去表土 1--2cm，以无菌铲采土足量充分混匀后用无菌塑料袋分装。
〔二〕好气性细菌的别离纯化及测数1.制备土样稀释液吹吸三次混匀无菌操作另留一管不稀释留作对照〔C K〕2.培养基的准备融化牛肉膏蛋白胨培养基，融化后保温在48℃。
并取6个无菌培养皿，分别在皿底贴好标签，注明10-5、10-6、CK〔每个稀释度要两个平行皿，对照要两个平行皿〕。
3.倾注法接种先按10-6，10-5的顺序将不同稀释度菌悬液接入对应平皿中〔每个平皿接入1ml〕，再向每个平皿倾注约15ml的牛肉膏蛋白胨培养基〔48℃〕待冷凝，混合均匀。
4.保温培养将已经接种的平皿静置10min后，放入温箱倒置培养3--5日〔30℃〕，观察结果。
5.分区划线法纯化平板划线别离，其划线方法有以下两种：6.计数要求30~300之间计数。
CK除外。
每克湿土样细菌数量＝平均菌落数×稀释倍数土壤样品水分系数1∕〔1—样品水分百分数〕土壤样品细菌数量〔个∕克干土〕＝每克湿土样细菌数量×样品水分系数四实验报告及思考题记录计数结果并计算土壤样品含菌数。
实验六 土壤中真菌纯化、分离和培养
土壤稀释液的制备和稀释液的取样
2、分离方法 采用稀释平板分离法。又可分为两种 方法。
混菌法和涂抹法。
混 菌 法
涂 抹 法
3、培养
将上述接种土壤悬液的平板 倒置于28℃培养3-5d。
4、挑菌纯化 5、计数
6、菌种保存
将分离到的真菌转接到PDA斜面上培 养，待长好后，置于冰籍中保存，必要时 进行深入研究。
?4挑菌纯化?5计数?6菌种保存将分离到的真菌转接到pda斜面上培养待长好后置于冰籍中保存必要时进行深入研究
实验六
土壤中真菌分离、纯化和培养
一、目的要求
掌握从土壤中初步分离培养真菌的方法， 从而获得真菌纯培养技能；了解基本接 种技术。
二、实验原理
土壤是微生物生活的大本营，是寻找和发 现有重要应用潜力的微生物的主要菌源。 不同土样中各类微生物数量不同，一般土 壤中细菌数量最多；其次为放线菌和霉菌。 本次实验从土壤中分离真菌。
三、仪器和材料
样品：新鲜土壤 培养基：加有2ml链霉素的PDA培养基。 无菌水：装有9mL无菌水的试管4支。 其它：无菌培养皿4皿、无菌吸管、酒精 灯、培养箱等 。
四、真菌纯种分离的操作方法
1、土壤稀释液的制备
用“稀释平板计数法”中的方法 进行，将土样稀释至10－5。
将1瓶土壤菌液（称取土样10g放入盛90 mL无菌水）和4管9mL的无菌水排列好， 按10-1、10-2、10-3、10-4及10-5依次编号。 在无菌操作条件下，用lmL无菌移液管吸 取lmL10-1浓度的菌液于一管9mL无菌水 中，将移液管吹洗三次，摇匀即为10-2浓 度菌液。同样方法，依次稀释到10-5。 注意：在土壤稀释过程中，吸取不同梯 度的菌液需换用不同的吸管。
实验四 土壤微生物的分离和计数
牛肉膏蛋白胨培养基； 高氏1号培养基； 马铃薯葡萄糖培养基（添加有抗生素）；
灭菌水、移液器、吸头、接种针、涂布器、灭 菌离心管、消毒酒精、试管架、记号笔、吸水 纸、酒精灯、平皿、漩涡振荡器、天平等。
实验内容
土壤微生物的分离和纯化 系列稀释法 划线法（讲解） 分离微生物的形态观察 （3天后） 细菌 放线菌 真菌
记录系列稀释法分离土壤微生物的结果：
真菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 细菌菌落的种类和数量，菌落特征描述； 放线菌菌落的种类和数量，菌落特征描述；
通过试验和查阅资料，独立完成思考题。 实验中出现问题的分析和讨论。
3天后观察记录分离试验结果，上交实验报告。
思考题：
在分离真菌时，有哪些方法可以避免或减少 细菌的污染？
称取土壤样品0.5~1.0 g加入含30ml灭菌水的塑料离心管 中振荡3～5分钟（旋涡振荡器），形成土壤悬浊液； 取0.1ml加入装有0.9ml灭菌水试管中，振荡均匀。依次稀 释，共5次。 细菌的分离：取第3，4，5 ，6四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在牛肉膏蛋白胨培养平板上； 放线菌的分离：取第1，2，3 ，4四个稀释水平的样品分 别取0.1ml，均匀涂布在高氏1号培养基； 真菌的分离：取第2，3，4 ，5四个稀释水平的样品分别 取0.1ml，均匀涂布在含抗生素的PDA平板上； 菌液被培养基吸收后，反转放置，做好标记，28℃培养。
细菌菌落的共同特征
湿润 粘稠 质地均匀 较透明 易挑取（与培养基结合不紧密） 菌落正、反面、边缘、中心颜色一致
注意事项：
土壤微生物计数法
土壤微生物计数法土壤是最复杂、最丰富的微生物基因库，所含微生物不仅数量巨大，而且各类繁多，主要包括细菌、真菌和放线菌三大类，是土壤最活跃的成分。
土壤微生物数量测定方法可分为三大类：一类是根据在培养基上生长的菌落数来计算土壤微生物的数量，统称为培养计数法，主要有稀释平板法和最大或然计数法；二类是将土壤微生物染色后，在显微镜下观察计数，称为直接镜检法，包括涂片法、琼脂薄片法和膜过滤法等；三类是直接将微生物从土壤中分离和提取出来后再进行测定，主要有离心分离法。
1.1培养计数法1.1.1概要在自然条件下，土壤中的大多数微生物处于休眠状态，一旦供给可利用的碳源（如培养基），一些微生物将快速生长繁殖。
因此，根据在培养基上所生长的微生物数量，可以估算土壤中微生物的数量。
这种土壤微生物数量测定方法称为培养计数法，主要包括稀释平板计数法（简称稀释平板法）和最大或然计数法。
稀释平板计数法的基本原理：土壤微生物经分散处理成为单个细胞后，在特殊的培养基上生长并形成一个菌落，根据形成的菌落数来计算微生物的数量。
最大或然计数法的基本原理：假设被测定的微生物在稀释液中均匀分布，并在试管或平板上全部存活，随着稀释倍数的加大，稀释液中微生物的数量将越来越少，直到将某一稀释度的土壤稀释液接种到培养基上培养后，没有或很少出现微生物菌落。
根据没有出现菌落的最低稀释度和出现菌落的最高稀释度，再用最大或然计数法计算出样品中微生物的数量。
1.1.2稀释平板法一、试剂配制常用的培养基各类很多（见附录一），可根据需要测定的微生物种类选择培养基。
按配方配制培养基后，先在121℃下灭菌15min，冷却至45～50℃使用。
凝固后的培养基可加热溶解后使用。
二、仪器设备广口瓶或三角瓶及配套的橡皮塞，移液管（1ml、10ml，吸口用棉花塞住后用牛皮纸包好灭菌）培养皿（9㎝，用牛皮纸包好后灭菌）和显微镜等。
（1）土壤系列稀释液制备取新鲜土壤（＜2㎜）10.00g，放入经灭菌的装有70ml水的广口瓶中，塞上经灭菌的橡皮塞，在振荡机上振荡10min，此为10-1土壤稀释液。
土壤真菌分离和计数方法的探讨
沈阳农业大学学报,2000-10,31(5):515-518Journal of Shen y an g A g ricultural Universit y,2000-10,31(5):515-518土壤真菌分离和计数方法的探讨梁晨,吕国忠(沈阳农业大学植保系,辽宁沈阳110161)摘要:综述了分离土壤真菌的方法以及测定土壤真菌的间接计数法和直接计数法;介绍了常见的分离和计数培养基;评价了各种方法和培养基的优缺点;并着重讨论了各种分离和计数方法的应用。
关键词:土壤真菌;分离;计数;培养基中图分类号:S432.4+4文献标识码:A文章编号:1000-1700(2000)05-0515-04A pp roach on Isolation and E numeration Methods of Soil Fun g iLI ANG Chen,LU G uo-zhon g(De p artment o f Plant Pr otection,Shen y an g A g r icultural Univ er sit y,Shen y an g110161,China)Abstract:T hat of isolation m ethods for soil fun g i and the indirect and direct enum eration m ethods for m easurin g soil fun g i;w as re2 v iew ed.Authors listed comm on m edia for enum eration and isolation;valued the advanta g es and disadvanta g es of the of fun g i of m eth2 ods and m edia;and focused on discussin g the a pp lication of these m ethods for isolation and enum eration.K e y w ords:soil fun g i;isolation;enum eration;m edium60年代以来,微生物生态学研究发展较快,推动了土壤微生物学的研究,人们的兴趣转向了解土壤中真菌存在的形式、数量、活性以及它们在物质转化中的重要作用。
检测土壤真菌数量操作规程
检测土壤真菌数量操作规程1. 引言土壤真菌数量的检测对于农业生产和环境保护具有重要意义。
本文档旨在提供一份操作规程，以帮助研究人员或实验室技术人员准确地检测土壤中的真菌数量。
2. 实验仪器和试剂准备2.1 实验仪器： - 显微镜 - 离心机 - 反应管或离心管 - 称量器 - 镊子或医用手套（用于样品处理）2.2 试剂： - 高温灭菌的蒸馏水 - 无菌培养基 - 过滤膜3. 样品采集3.1 样品选择： - 选择代表性的土壤样品，可以根据研究目的或采样位置进行选择。
- 避免采集过于湿润或干燥的土壤样品。
3.2 采样工具： - 使用无菌手套、镊子或其他无菌工具进行样品采集，避免外源性污染。
3.3 采样方法： - 在采样点附近挖取一块土壤，深度为10-20厘米。
- 将采样的土壤置于干燥的容器中，并尽快送入实验室进行处理。
4. 样品处理和离心4.1 样品干燥： - 将采集的土壤样品均匀分布在干燥的容器内，放置在通风处晾干。
- 避免土壤样品与其他异物接触，以防止污染。
4.2 样品研磨： - 将干燥的土壤样品研磨成粉末状，并过筛以去除较大的颗粒。
4.3 样品称量： - 取一定量的土壤样品，称量精确记录，并记录样品的湿重。
4.4 样品提取： - 使用高温灭菌的蒸馏水对称量好的土壤样品进行浸泡提取，保持一定时间（例如12小时）。
4.5 离心： - 将提取的土壤悬浊液进行离心，以分离土壤颗粒和真菌孢子。
5. 真菌数量检测5.1 过滤悬浊液： - 将悬浊液通过无菌的过滤膜过滤，以去除土壤颗粒。
5.2 培养基制备： - 准备无菌培养基，并按照制备说明进行培养基的配制。
5.3 填充培养基： - 将过滤后的悬浊液均匀地倒入培养基平板中。
5.4 培养： - 将培养基平板放入恒温培养箱中，在适当的温度下孵育一段时间（例如48小时至72小时）。
5.5 统计计数： - 借助显微镜观察并统计培养基平板上的真菌数量。
- 在视野内随机选择若干个区域，计数并记录每个区域中的真菌数量。
土壤真菌分离
一、实验目的：掌握活菌计数的基本原理及方法。
二、实验原理-----稀释平皿计数法。
将微生物充分稀释到单个分散，把这些单个分散的细胞均匀涂布在平皿培养基上，培养后长出的菌落肉眼可见，每个菌落都由原液中单个细胞发育而来，计算菌落数，通过公式可以求出单位原样品的活菌数。
三、材料3.1土壤样品按随机采样获得的土样1、土样2、土样3、土样4。
3.2仪器高压灭菌锅、培养箱。
3-3培养基和试剂马丁氏培养基：K2HP04 1.0g、葡萄糖10. 0g、MgS04.7H20 0.5g、琼脂18. 0g、蛋白胨5. 0g、水l000ml，此培养基液l000ml 入1%孟加拉红水溶液3.3 ml．临用时每100 ml培养基中加1%链霉素液0. 3ml，主要用于土壤真菌的分离。
四、实验步骤真菌的分离和计数（1）无菌器材的准备，包括无菌培养皿，无菌移液管和无菌水。
(2) 准确称取10g土样和量取100ml蒸馏水，将盛有10g土样和100 ml蒸馏水的三角瓶放在振荡机上振荡10 min，使土样均匀地分散在稀释液中成为土壤悬液。
(3)土壤分散后，吸取1ml悬液到9ml稀释液中，依次按10倍法稀稃，稀释到10-6。
所用的吸管在每次吸取悬液时，在稀释液中反复吸入吸出3-5次，使管壁部分饱和以减少因管壁吸附造成的误差，并使悬液进一步分散。
(4)先在无菌培养皿中倾注18ml左右改良马丁氏培养基，凝固后，用1ml无菌吸管加0. 2ml -定稀释度的土壤悬液于琼脂表面，然后立即用玻璃棒将稀释倍数10-1的悬液均匀地涂抹于琼脂表面，必须注意应从高稀释度开始，然后依次接种较低稀释度的悬液。
（5）接种的土壤悬液的培养皿，于28-30℃恒温箱倒置培养5-7天。
(6)真菌菌落计数方法：以菌落在10-100个的稀释度计算3个平板的平均数。
（7）结果计算：每克干土中的菌数=(同一稀释度三个平板的菌落平均数×稀释倍数)/干土%．。
微生物学 实验7 土壤中细菌的分离纯化及计数
3.78 ×104 2.71 ×104
5.13 ×105 2.70 ×102 采用科学计数 法；取两位小 数
６
无法计数
305
12
－
3.05 ×104
“无法计数”——指因稀释倍数掌握不好或其它原因造成不能计数， “0”——指平板上无微生物菌落生长。
五、作业
1、将每一个稀释度的三个平板上的菌落数填入下表，并计算结果
4、若所有稀释度的平均菌落数均大于300，则应 按稀释度(倍数)最高的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例4）。
5、若所有稀释度的平均菌落数均小于30，则应按 稀释度(倍数)最低的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例5）。 6、若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300之 间，则以最近300或30的平均菌落数乘以稀释倍数 （见下表，例6）。
菌落计数原则（六条）
1、先计算相同稀释度的平均菌落数。若其中一个 平板有较大片状菌苔生长时，则不应采用，而应 以无片状菌苔生长的平板作为该稀释度的平均菌 落数。若片状菌苔的大小不到平板的一半，而其 余的一半菌落分布又很均匀时，则可将此一半的 菌落数乘2以代表全平板的菌落数，然后再计算该 稀释度的平均菌落数。
三、实验材料
1、牛肉膏蛋白胨培养基、土壤样品、无菌 水 2、培养皿、玻璃试管、胶头滴管、涂布棒
四、实验步骤
1、细菌的分离纯化——稀释涂布平板法
（1）试管和培养皿编号 在试管壁上依次标上10-2、 10-3、10-4、 10-5、10-6。在培养皿养皿的底部依次标上10-4-1、 10-4-2 、 10-5-1 10-5-2 、10-6-1、 10-6-2。 （2）倒平板 将牛肉膏蛋白胨固体培养基融化（微波炉加热3min5min），待培养基冷却至不烫手时（约50℃），无菌倒入已编号的 培养皿中，室温凝固，备用。 （3）土壤稀释液制备。称取10g土壤至盛有90mL无菌水的三角瓶 中，震荡15-20min，静置约20～30秒，即成10-1的土壤悬液。用胶 头滴管移取1 mL菌悬液至标有10-2的离心管中，震荡混匀，制成102的菌悬液；从10-2管中取1 mL菌悬液至标有10-3的离心管中，震荡 混匀，制成10-3的菌悬液；同法依次制备10-4、10-5、10-6的菌悬液。
【精品】实验四 土壤微生物的分离和计数
【精品】实验四土壤微生物的分离和计数实验目的：1.掌握土壤微生物的分离方法。
2.利用平板计数法和涂布法等方法进行土壤微生物的计数。
实验原理：1.微生物分离法微生物分离法是将微生物从混合物或样品中分离出来的方法，是微生物学中最常用的一种基本方法。
常用的方法有稀释平板法、涂布法等。
2.平板计数法平板计数法又称菌落计数法，是通过数目测定评估微生物数量的方法。
通常在固体培养基上用微生物悬液接种，培养出菌落，以评估菌群密度。
计算微生物数量时应选择符合菌落特征的一个菌落，如颜色、密度、大小等，并使用总体积、稀释因子及加样体积计算。
3.涂布法涂布法又称涂布分离法，是一种快速、容易、简单、实用的微生物分离和计数方法。
方法是取少量样品加入到无菌的琼脂培养基中，将琼脂培养基均匀地涂布在培养皿中，然后在恰当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，最后计算菌落单位体积的数量。
实验材料和设备：1.土壤样品；化学试剂：蒸馏水、1%碳酸氢钠溶液、1%双氧水溶液、1.5%琼脂等。
2.培养皿；吸管；移液管；吸胶头；灭菌器；微量注射器等。
实验步骤：1.准备样品：取土壤样品，干燥，粉碎，筛选出粒径较小的部分备用。
2.制备0.1g/ml的悬液：取粉碎好的土壤样品0.1克，加入到10ml的蒸馏水中，用吸管吸取混合后的液体，摇匀后待沉淀，取稠泥状上清液，稀释成0.1g/ml的土壤悬液。
3.平板法计数：取一定体积的土壤悬液接种在称量好的琼脂平板上，进行涂布，涂布均匀后，放置在恰当的温度下，培养约24小时，以单个菌落的数量（单位：cfu/ml）计数，并使用公式计算微生物数量。
4.涂布法计数：用吸管吸取一定体积的土壤悬浊液，加入到10ml的液体琼脂培养基中，均匀地涂布在培养皿中，在适当的温度下和时间内使菌落正常增殖及显像，然后计算菌落单位体积的数量。
实验记录和数据处理：1.记录实验过程、结果和分析。
2.计算平板菌落数量和涂布法菌落数量。
3.对实验结果进行分析比较，得出结论。
土壤真菌计数实验报告
1. 了解土壤真菌的种类及分布情况；2. 掌握土壤真菌计数的实验方法；3. 培养实验操作技能，提高对微生物实验的敏感性。
二、实验原理土壤真菌是土壤微生物的重要组成部分，对土壤肥力、物质循环和生物多样性具有重要意义。
真菌计数是研究土壤真菌多样性的重要手段之一。
本实验采用稀释涂布平板法对土壤真菌进行计数，通过观察和记录菌落数量，分析土壤真菌的种类及数量。
三、实验材料与试剂1. 实验材料：土壤样品（需新鲜、无污染、富含有机质）；2. 试剂：无菌水、无菌生理盐水、马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）、无菌玻璃棒、无菌培养皿、酒精灯、无菌移液器、无菌剪刀、无菌镊子、无菌手套、显微镜等。
四、实验步骤1. 样品制备：取土壤样品50g，加入450ml无菌水，充分振荡，使土壤充分悬浮；2. 稀释：取上述土壤悬液，用无菌生理盐水进行10倍系列稀释；3. 涂布平板：取适量稀释液，用无菌玻璃棒均匀涂布在PDA平板上；4. 培养与观察：将涂布好的平板倒置，置于37℃恒温培养箱中培养48小时；5. 计数：观察平板上的菌落，记录菌落数量；6. 结果分析：根据菌落数量，计算土壤真菌的数量。
五、实验结果与分析1. 土壤真菌的种类：根据菌落形态特征，初步鉴定出土壤真菌种类，如青霉、曲霉、毛霉等；2. 土壤真菌的数量：根据菌落数量，计算出土壤真菌的数量，如每克土壤中含有1.2×10^6个真菌。
本实验成功对土壤真菌进行了计数，初步了解了土壤真菌的种类及数量。
实验结果表明，土壤真菌在土壤中广泛分布，种类丰富，对土壤生态系统具有重要作用。
七、实验注意事项1. 实验过程中，严格遵循无菌操作原则，防止污染；2. 稀释倍数要准确，以免影响实验结果；3. 培养时间不宜过长或过短，以免影响菌落数量；4. 记录菌落数量时要仔细，避免遗漏。
八、实验总结本次实验通过土壤真菌计数，了解了土壤真菌的种类及数量，掌握了土壤真菌计数的实验方法。
实验过程中，我们注重无菌操作，确保实验结果的准确性。
土壤真菌分离和计数方法的探讨
土壤真菌分离和计数方法的探讨土壤真菌分离和计数方法的探讨1. 前言在土壤生态系统中，真菌是一群重要的微生物，其在有机质分解、养分循环和土壤生物多样性维持中发挥着关键作用。
准确、快速地分离和计数土壤中的真菌对于了解土壤生态系统的功能和稳定性具有重要意义。
2. 真菌分离方法（1）传统培养法传统培养法是最常用的真菌分离方法之一。
这种方法通常涉及将土壤样本转移到培养基上，并通过定期观察培养基上的真菌菌落来确定真菌的存在与否。
然而，传统培养法对于某些真菌可能存在的耐受性较差，且会导致样本中一部分真菌无法得到分离。
（2）分子生物学方法分子生物学方法在真菌分离中扮演着越来越重要的角色。
聚合酶链反应（PCR）和序列技术可以直接从土壤样本中提取DNA并进行分析，从而确定真菌的物种多样性和数量。
这种方法不仅快速，而且可以辨别出难以通过传统培养法分离的真菌，极大地丰富了我们对土壤真菌的认知。
3. 真菌计数方法（1）菌落计数法菌落计数法是常用的真菌计数方法之一。
这种方法基于在培养基上生长的真菌菌落数量来估算土壤中真菌的数量。
虽然该方法操作简单，但仅适用于某些真菌，且结果易受外界环境和培养条件的干扰。
（2）荧光定量PCR荧光定量PCR（qPCR）是一种利用引物和荧光标记测定DNA数量的方法。
通过与已知真菌序列进行比对，可以使用qPCR来快速、准确地估计土壤中真菌的数量。
因为qPCR对真菌DNA进行定量，所以可以得到相对可靠的结果，并且可以通过标准曲线等方法进行进一步校正。
4. 个人观点和理解研究土壤中真菌的分离和计数方法对于揭示土壤生态系统结构和功能至关重要。
传统培养法虽然常用，但其存在一定局限性，且耗时较长。
我推荐结合分子生物学方法和荧光定量PCR来对土壤真菌进行研究。
通过分子生物学方法，可以直接从土壤样本中提取DNA，并使用PCR 和序列技术来确定真菌的物种多样性。
这种方法不仅可以快速获得结果，还可以鉴定出一些传统培养法无法分离的真菌。
实验七稀释平板计数法及土壤中真菌的分离纯化
1、超净工作台 2、玻璃刮铲 3、酒精棉球
5
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四、实验步骤---稀释平板计数法
1、熔化培养基 2、倒平皿 3、梯度稀释法稀释原菌样品
6
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四、实验步骤
4、涂平皿： 选取1/106,1/107,1/108三个稀释度计数，每皿取
菌液0.1ml，用玻璃刮铲涂布均匀，每个稀释度做一 个重复。
2、若所有稀释度的菌落平均数均小于30，则按稀释倍数最低的平均菌落
数乘以稀释倍数报告；
8
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四、实验步骤---从土壤里分离真菌
1、熔化培养基 2、倒平皿 3、捻碎土样，将土样溶解在90ml无菌水三角瓶中 4、梯度稀释法稀释土样
10g 10-1
90ml
9
10-2
10-3
10-4
1可0-5 编辑版
4、涂平皿： 每个稀释度均需要涂布平皿，每皿取菌液0.1ml，
用玻璃刮铲涂布均匀。
5、28℃倒置培养3~7天
6、观察并描述真菌菌落特征
10
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五、实验结果及分析
稀释平皿计数法：
稀释倍数 106
107
108
菌落数
每ml原菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU＝
（同一稀释度平板上菌落平均数×稀释倍数）/原菌样品体积
（ml）
11
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描述酵母菌菌落特征： 描述霉菌菌落特征
12
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实验七 稀释平板计数法及土壤中真菌的 分离纯化
1
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一、实验目的
掌握活菌计数的基本原理及方法 掌握从样品中分离目的微生物的原理-稀释平皿计数法
将微生物细胞充分稀释到单个分散，把这些单个分散 的细胞均匀涂布在平皿培养基上，培养后长出的菌落 肉眼可见，每个菌落都由原液中单个细胞发育而来， 计算菌落数，通过公式可以求出单位原样品中的活菌 数。
检测土壤真菌数量操作规程
检测土壤真菌数量操作规程土壤真菌数量的检测操作规程主要包括样品采集、处理和分析三个步骤。
以下是一个简要的操作规程，具体细节可以根据实际情况进行调整。
一、样品采集1. 根据研究目的和采样点分布合理设置采样区域。
2. 在每个采样点内，使用无菌手套和无菌工具，选取5-10个随机的土壤样品点。
每个样品点的深度应从表层到30cm之间。
3. 使用无菌小铲或样品勺，将每个样品点的土壤取自表层到30cm深度，并放入无菌采样袋中。
4. 将采样袋密封并用标签标明采样点编号和采样日期，确保采样点和样品的准确对应。
二、样品处理1. 将采样袋中的土壤样品均匀混合，取出适量样品用于后续分析。
样品量的选择需要根据具体分析方法和样品数量进行调整。
2. 如果采样土壤湿润，应将样品在通风处晾干，并记录样品湿重和干重。
三、真菌数量分析1. 准备所需的培养基和培养器具。
选择适合真菌生长的培养基，如马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）等，并按照制造商的指导说明制备培养基。
2. 使用无菌技术将土壤样品转移到培养基上。
可以采用两种方法：1）将土壤样品均匀撒在培养基表面；2）将土壤样品与培养基混合，再均匀涂抹于培养基表面。
3. 密封好培养皿，并将其放置于适当的温度和光照条件下，以便真菌生长。
通常情况下，温度为25-30°C，光照条件为暗处。
4. 对培养皿上真菌数量进行观察和计数。
可以使用显微镜对孢子进行计数，或者使用显色剂对真菌进行染色并使用数字图像处理软件进行计数。
5. 根据观察和计数结果，计算出每个样品点的真菌数量。
四、数据处理和统计分析1. 将每个样品点的真菌数量记录下来，并整理成数据表格。
2. 可按照研究目的进行进一步的统计分析，如计算均值、标准差等，以及用图表展示结果。
3. 根据实验设计和研究问题，进行适当的统计检验，如t检验、方差分析等。
五、质量控制和质量保证1. 在样品采集、处理和分析过程中，尽量避免污染，使用无菌技术操作。
2. 注意细致地记录每个步骤的操作细节，以保证结果的准确性和可重复性。
土壤真菌分离计数
兼用于土壤真菌的分离和计数：孟加拉红琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基(PDA)、麦芽浸汁琼脂培养基(MEA)和牛胆汁琼脂培养孟加拉红琼脂培养基是一种组合培养基，成分准确，其上发育的真菌数量及种类较多，放线菌及大部分细菌易被孟加拉红和链霉素所抑制，但真菌菌落较小，是最常用的土壤真菌分离和计数培养基。
然而由于孟加拉红琼脂培养基对真菌菌落和繁殖器官形成的限制，以及染料影响在原始平皿上正常识别某些真菌，与酸性培养基相比，必须转移更多的菌落到其它的培养基上。
PDA和MEA均为酸化的天然培养基，能抑制全部细菌和放线菌。
但由于酸度过高。
有些耐酸性较弱的真菌，在其上不能发育，因此出现的数量及种类都比孟加拉红琼脂培养基上低。
牛胆汁琼脂培养基上菌落发育不大，放线菌和细菌也全部被抑制，数量准确，但由于结晶紫的影响，不易在培养基上直接鉴定。
土壤真菌常用的分离方法：1、稀释法此种方法在土壤真菌分离中最常用，用无菌水将土壤稀释后得到10-3～10-4的悬浮液，将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上，菌落长成后，将单个菌落挑出、培养、鉴定。
这种方法对土壤中产孢量大的半知菌、子囊菌和接合菌，如青霉属Penicillium，曲霉属Aspergillus和毛霉属Mucor等有利，所分离到的主要是以孢子形态存在于土壤的真菌，以菌丝体形式存在的则较难分离到。
这种方法分离的真菌并不能代表土壤中真菌的真实存在情况，因为部分真菌的孢子和菌丝经常附着在土壤颗粒上，没有被充分洗脱下来，因而也就无法继续培养，这样有可能丢失了很大部分真菌。
2、土壤平板法将一定量土壤(一般1.5~5 mg)移入灭菌的培养皿中，涂平，然后倒入冷却至45℃的培养基，摇匀后培养；或将土壤直接加在冷却后的培养基表面培养。
稀释法分离过程中，附着在矿物粒子或埋藏在腐殖质内的真菌不易分离到，此种方法可较全面获得土壤中的真菌，除了以休眠孢子存在的真菌还可以分离以菌丝存在的真菌。
若土壤中存在腐霉（Pythium）、木霉（Trichoderma）或毛霉（Mucor）等真菌，由于生长过快，会很快覆盖培养皿而不易分离得到其他生长相对慢的真菌，因此该方法对生长较快的真菌有利。
实验五土壤中微生物的分离计数
（四）悬液稀释
无菌操作采用－4，－5，－6 稀释液涂布牛肉膏蛋白胨平 板;每个稀释度2个重复。每人用剩下的1个平板做划线分
离，从三角瓶中取土壤悬液作划线分离。
10克
土样
10-1
90毫升
无菌水
10-2
10-3
第四页，课件共13页
10-4
10-5
第五页，课件中微生物的分离计 数
第一页，课件共13页
一、实验目的： 学习微生物稀释平板计数及划线分离技术 二、实验原理:
➢采用适宜（选择）培养基和培养条件，或加入某种抑制剂有 利于目标微生物的生长，从而分离获得目标微生物的纯培养 ：常用稀释平板分离法和划线分离法
在固体培养基上形成单个菌落。 ➢依据一个单细胞在固体培养基上培养后可以长成一菌落 从而推算样品中含有多少细菌的活菌数目。
Liquid specimen is spread on the surface of solid agar with a sterile bent glass rod.
简单易行，但易
造成机械损伤
第六页，课件共13页
（六）培养：
将平板用报纸包好（每个平板方向一致）， 写上班级和姓名，皿底朝上，置于培养箱培 养(温度37℃) 。
第七页，课件共13页
（七）细菌计数结果
稀释度
平板
菌落数
各浓度平 均菌落数 土壤中含 细菌数量
10-5 12
10-6 12
10-7 12
第八页，课件共13页
四、平皿划线 分离法
第九页，课件共13页
特点：快速、方便。
分区划线（适用于浓度较大的样品） 连续划线（适用于浓度较小的样品）
第十页，课件共13页
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兼用于土壤真菌的分离和计数：孟加拉红琼脂培养基、马铃薯琼脂培养基(PDA)、麦芽浸汁琼脂培养基(MEA)和牛胆汁琼脂培养孟加拉红琼脂培养基是一种组合培养基，成分准确，其上发育的真菌数量及种类较多，放线菌及大部分细菌易被孟加拉红和链霉素所抑制，但真菌菌落较小，是最常用的土壤真菌分离和计数培养基。
然而由于孟加拉红琼脂培养基对真菌菌落和繁殖器官形成的限制，以及染料影响在原始平皿上正常识别某些真菌，与酸性培养基相比，必须转移更多的菌落到其它的培养基上。
PDA和MEA均为酸化的天然培养基，能抑制全部细菌和放线菌。
但由于酸度过高。
有些耐酸性较弱的真菌，在其上不能发育，因此出现的数量及种类都比孟加拉红琼脂培养基上低。
牛胆汁琼脂培养基上菌落发育不大，放线菌和细菌也全部被抑制，数量准确，但由于结晶紫的影响，不易在培养基上直接鉴定。
土壤真菌常用的分离方法：1、稀释法此种方法在土壤真菌分离中最常用，用无菌水将土壤稀释后得到10-3～10-4的悬浮液，将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上，菌落长成后，将单个菌落挑出、培养、鉴定。
这种方法对土壤中产孢量大的半知菌、子囊菌和接合菌，如青霉属Penicillium，曲霉属Aspergillus和毛霉属Mucor等有利，所分离到的主要是以孢子形态存在于土壤的真菌，以菌丝体形式存在的则较难分离到。
这种方法分离的真菌并不能代表土壤中真菌的真实存在情况，因为部分真菌的孢子和菌丝经常附着在土壤颗粒上，没有被充分洗脱下来，因而也就无法继续培养，这样有可能丢失了很大部分真菌。
2、土壤平板法将一定量土壤(一般1.5~5 mg)移入灭菌的培养皿中，涂平，然后倒入冷却至45℃的培养基，摇匀后培养；或将土壤直接加在冷却后的培养基表面培养。
稀释法分离过程中，附着在矿物粒子或埋藏在腐殖质内的真菌不易分离到，此种方法可较全面获得土壤中的真菌，除了以休眠孢子存在的真菌还可以分离以菌丝存在的真菌。
若土壤中存在腐霉（Pythium）、木霉（Trichoderma）或毛霉（Mucor）等真菌，由于生长过快，会很快覆盖培养皿而不易分离得到其他生长相对慢的真菌，因此该方法对生长较快的真菌有利。
3、菌丝分离法一定量土壤充分冲洗后，过孔径50μm的筛，残留筛上的土粒置于培养皿中，体视镜下观察，将黏附于土粒上的菌丝或菌丝块取出，置于培养皿中，然后倒入培养基培养，将生长的新菌丝顶端切下后再培养，这种方法分离的真菌一般都是前两种方法未分离到的。
该方法对以下真菌的分离有利：菌丝较粗；不易断裂；颜色较深。
但这种方法获得的分离物在培养过程中，经常作为不育菌丝的形态存在，难以产孢，因此无法鉴定，而且费时、费力，不是很常用。
4、诱饵法这是一种生物学的方法，适合于从土壤中分离数量较少的特定真菌，即将“诱饵”埋入土壤一段时间，取出后直接培养以此获得所需要的真菌。
分离的真菌不同，所选用的诱饵也不同，如大麻种子就是分离水生菌以及腐霉属Pythium很好的诱饵；而凤梨的茎和叶子能够诱集Phytophythora cinnamomi；胡萝卜的圆片可以诱集Thielaviopsis basicola；土豆的块茎诱集Phytophthora infestans；喜角质的壶菌常用的诱饵为人的毛发。
5、其他的分离方法孢子悬浮法：最初用来分离长蠕孢属Helmithosporium，也适于分离其他以孢子状态存在土壤的真菌。
干燥法：通过将土样用氯化钙干燥后，进行分离。
该种方法分离获得的是在土壤中以孢子状态存在的真菌，而以菌丝状态存在的真菌则因为干燥失水死亡。
埋管法和Rossi-Cholodny埋片法：这两种方法中，生长旺盛、对低氧忍耐较强的真菌比较容易分离到，较易分离以活跃菌丝存在的种类，如立枯丝核菌Rhizocotoniasolani。
土壤真菌计数法直接计数法培养后测定菌落数【稀释平板法、土粒法以及最大概率数值法】间接计数法土壤真菌染色后在显微镜下计数【Rossi-Cholodny埋片法、Jones-Mollison 法、Thornton-Gray (Ratio)法、土壤切片法、荧光抗体法以及电子显微镜直接观察法、荧光显微镜观察法等】直接计数法稀释平板法根据土壤中真菌的数量，一般采用的稀释度为10-1~10-3，同时称取待测土样10g左右，经105℃烘干8h，置于干燥器中，待冷却后称重，计算土壤含水量的百分数。
用混菌法和刮刀法将土壤悬液接种在培养皿中，重复4次，于28~30℃恒温箱中培养5~7d，选取菌落数在10~100的培养皿进行计数(剔除扩散性真菌菌落占据琼脂表面15%的培养皿)。
最大概率数值法以烟草黑腐病菌根串珠霉(Thielaviopsis basicola)为例，取烘箱干燥土样10g。
用每毫升含60μg金霉素的灭菌蒸镏水配制每级10倍的稀释液至10-5或10-6。
在铺有滤纸的培养皿内放3片10mm厚的胡萝卜片，用直径23mm的打孔器在上面打出一凹穴，加入稀释液1mL，重复3次。
接种6~7d，记录发病胡萝卜饼数目。
若2~6次稀释度中获得阳性结果(5，4，2，0，0)。
以p1为5，p2为4，p3为2的值，查表得近似值2.2。
土粒法对于不产孢子的真菌，采用将土粒接种在选择性培养基上的方法来分离计数。
取少量土样加无菌水调成糊状，用圆头玻璃棒在平板上点样，适温下培养一定时间后，观察生长情况，结果以百分数表示。
此方法只能得到不同土壤之间同类真菌数量的比较粗略的数据。
间接计数法Rossi-Cholodny埋片法将载玻片埋在土壤中，经过一定时间后镜检测定载玻片表面生长的微生物的半定量方法。
真菌一般放大400~600倍，每枚标本片观察100~400个视野，以检出真菌的视野数与总视野数之比表示生育量(检出频率%)。
此方法适用于测定不同时期不同土壤中真菌菌丝体丰度，然而不能测定每单位重量土壤的菌数(生育量)。
毛细管法根据微生物利用土壤本身的毛细管系统输送的空气和养分而生存的原理。
将灭菌的毛细管插入融化的0.2%琼脂中，然后安装在支架上，插入土壤中，一定时间后取出，用5%碳酸赤藓红染色，在显微镜下观察。
此方法能显示出天然生境下的微生物区系，并分离出许多未能为平板法所揭示的微生物种，但得不出单位重量土壤中所含真菌数量。
不过，反映出的数量仍可作为不同土壤之间的相对比较。
Jones-Mollison法依据Thornton(1934)等人的观点将土壤悬浮液与溶化的琼脂充分混合，再制成薄片，使土壤粒子与菌体均匀分散，提高测定总菌数的精确度。
本方法适用于土壤中的真菌的菌丝量的检出频率的测定。
以上3种方法由于菌体和有机物质同样被染色，要求操作熟练，但制成的标本保存时间较长。
上述3种显微镜直接计数法用酸性染料染色可将菌体和土壤颗粒分开，但无法区分活菌和死菌。
荧光显微观察法Strugger(1948)利用吖啶橙荧光显微镜技术区分活菌和死菌。
一般情况下，活菌比死菌吸收染料少，在荧光镜下分别显示亮绿色和暗红色。
此法可进行土壤真菌的定量测定。
克拉西里尼科夫提出在土壤样品表面，直接滴加吖啶橙溶液，在落射光照明的显微镜下观察，可以在不破坏土壤结构的情况下研究真菌在土壤中空间分布的状况。
还可利用添加熄灭剂来减弱土体的自体发光。
Fradkin等观察小麦根腐病菌禾旋孢腔菌(Cochliobolus sativus)和其它植物病原菌的分生孢子与菌丝繁殖时，用吖啶橙或铕螯合物染色，在荧光显微镜下可以明显区分真菌的各种结构。
常用的荧光染料还有异硫氰酸、1-苯胺、8-萘酚磺酸镁盐、二醋酸盐和萘啶酮酸，其中后两者只染活的微生物。
荧光抗体法用抗体和荧光素结合制成的荧光抗体试剂处理土壤样品，荧光抗体和存在于样品中的相应抗原产生特异性反应，在荧光显微镜下产生特定的荧光。
如果事先制备多种模式的荧光抗体。
就可对土壤样品中的相应抗原进行检验。
并且荧光抗体可长期保存。
本方法由荧光抗体的制备和荧光抗体标本的染色两部分组成，适用于涂抹标本、印片标本、土壤本身、埋片和土壤切片。
真菌多使用菌丝的匀浆作为抗原来制备抗体。
荧光抗体的染色方法有直接法、间接法及补体法等。
本方法可进行土壤真菌的定量测定，并且能够了解土壤真菌的组成情况。
电子显微镜直接观察法利用电子显微镜观察土壤悬液，用热吸附法制片，可观察到少见的真菌。
此方法比稀释平板法的测定结果高几百倍。
但改变了土壤的自然状态，且不能得到纯培养，不能直接作菌种的鉴定。
土壤切片法利用各种固定剂在不破坏土壤结构的条件下将土壤样本固定，制成观察微生物的剖面或薄片，再进行镜检。
自从Kubiena(1938)用塑性物质固定土壤，做了直接观察土壤微生物的试验以来，其后Haarlov & Weis-Fogh(1953，1955)等人试验以琼脂固定制作土壤薄片。
Mindermpn(1956)用明胶固定土壤，再以氟化氢处理，除去砂质，可制成7.5~10μm的薄片，再用Johansen(1940)的四重染色法，可将线虫、真菌、细菌、变形虫、土粒等区分清楚。
Alexander和Jackson(1954，1958)等人发明了用合成树脂固定土壤的方法，包括土样的采集、染色和洗涤、干燥、固定、切断、薄片的制作及向玻片上埋片。
Heppele和Burges(1956)及Burges和Nicholas(1960)等人使用Bukelite聚合树脂S.R.17497，设计出更简便的方法，测定土壤真菌菌丝量，并用于研究土壤层次与菌量的关系。
Jones和Griffiths(1969)根据Alexander 等人的方法做成土壤薄片样本，进行了土壤团粒中微生物存在状态的研究。