分子生物学常用技术上
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真核表达：Western Blot、ELISA、免疫组化
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4
(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平
细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。。。。。。。 (17)作用机制
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3
(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、
原位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测：
原核表达：SDS-PAGE (重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB
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9
核酸的基本组成
’
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10
1910年诺贝尔生理或医学奖
Albrecht Kossel
“其对蛋白质，包括核物 质的研究工作为我们了解 细胞化学作出了贡献”
揭示核酸的化学成分
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11
1957年诺贝尔化学奖
“核苷和核苷辅酶”
核苷酸的基本结构
Lord (Alexander R.) Todd
分子生物学常用技术
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1
PCR产物 A-T克隆
测序
重组表达载体
原核表达载体 酵母表达载体 昆虫表达载体
真核表达载体 病毒表达载体
制备抗体 重 组 蛋 白
检测活性 体内、体外
转染细 胞
作用机制
应用
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2
步骤：
(1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16℃过夜/22 ℃ 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃
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8
内容
1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE
分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学
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5
实验一
1. PCR：Pfu, 加A尾；[1208/8:00] 2. Agarose电泳：Goldview染色; [1208] 3. 核酸纯化：凝胶回收Kit; [1208] 4. Agarose电泳：检测回收条带; [1208] 4. 连接反应：pGMT, 22℃ 2h; [1208] 5. 转化：Top10, 热激法，蓝白筛选。 [1208]
实验四
1. SDS-PAGE：10%分离胶；[1215] 2. 转膜：湿转；[1215] 3. 封闭：RT 1h；[1215] 4. Ab1：4 ℃过夜 ；[1215] 5. Ab2：RT 40min ；[1216/8:00] 6. ECL：RT 5min ；[1216]
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7
实验 XXX
1. 设备：加样器 2. 耗材 3. 试剂和配制方法：详细 4. 步骤：详细
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6
实验三
百度文库
1. 转化：BL21, 热激法；[1208] 2. 挑克隆： 2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[1209/9:00] 3. 转接：1%过夜菌+ 2ml 含抗生素的LB , 2管; [1210/8:00] 4. 诱导：0.5mM和0.1mM的IPTG（终浓度）; [1210] 5. 碎菌：超声处理; [1215/8:00] 6. SDS-PAGE：10%分离胶，考兰染色，脱色。 [1215]
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12
1962年诺贝尔生理或医学奖
Francis Harry Compton Crick
James Dewey Watson
Maurice Hugh Frederick Wilkins
“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”
DNA分子的二级结构
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13
5’末端 (游离磷酸基)
特点
数量庞大 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 3’，5’-磷酸二酯键(共价键) 直线形多聚体 方向: 5’---3’ ，5’ CAG….. 3’
3’末端
(游离羟基)
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14
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15
DNA半保留复制
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16
变性与复性
变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，
实验二
1. 挑克隆：2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[1209/9:00] 2. 提质粒：Kit；[1210/8:00] 3. 重组质粒的鉴定：双酶切反应， 37 ℃ 2h；[1210] 4. Agarose电泳：Goldview染色；[1210] 5. 测序和序列比对：生物技术服务公司； [1213] 6. 菌种保存: 20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃。 [1215]
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19
注意事项：
(1) 试剂：pH值准确 (2) 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20℃，避免反复冻融 (3) 抽提：完全，不要触及蛋白层 (4) 干燥：避免过分 (5) 操作：小心，机械剪切作用，80~100kb
2. 总RNA的分离纯化: 略
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20
3. 质粒：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行
复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状 的共价闭环双链DNA分子。
低。
不涉及共价键断裂，不引起分子量降
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17
一、核酸的分离、纯化和鉴定
1. 基因组DNA的分离、纯化： PCR、Southern- blot、构建基因组文库
实验材料：哺乳动物组织(50~100mg) 哺乳动物细胞(5x105~107) 六孔板/T25
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18
实验步骤：RT
匀浆：TE pH8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase、37℃/55 ℃ 抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 洗涤：75％乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O
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4
(14)重组蛋白的纯化：亲和层析，His-tag/GST-tag (15)制备抗体：多抗和单抗 (16)基因功能检测：提高/降低表达水平
细胞周期检测：流式细胞仪 细胞增殖检测：MTT 细胞凋亡检测: 流式细胞仪、TUNEL、DNA Ladder 抑瘤活性检测：体外、体内 对血管化的影响 。。。。。。。 (17)作用机制
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3
(11)外源基因在哺乳动物细胞中的表达：质粒转染、电转染 (12)目的基因表达的鉴定：RT-PCR、Northern Blot、
原位杂交、Southern Blot (13)目的蛋白表达的检测：
原核表达：SDS-PAGE (重组蛋白诱导表达的诱导剂浓度、 诱导时间和温度、重组蛋白表达的形式)、WB
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核酸的基本组成
’
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10
1910年诺贝尔生理或医学奖
Albrecht Kossel
“其对蛋白质，包括核物 质的研究工作为我们了解 细胞化学作出了贡献”
揭示核酸的化学成分
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11
1957年诺贝尔化学奖
“核苷和核苷辅酶”
核苷酸的基本结构
Lord (Alexander R.) Todd
分子生物学常用技术
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1
PCR产物 A-T克隆
测序
重组表达载体
原核表达载体 酵母表达载体 昆虫表达载体
真核表达载体 病毒表达载体
制备抗体 重 组 蛋 白
检测活性 体内、体外
转染细 胞
作用机制
应用
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2
步骤：
(1)PCR (2)核酸的纯化：凝胶回收Kit (3)连接反应：16℃过夜/22 ℃ 2h (4)CaCl2法制备感受态细胞：Kit (5)宿主菌的转化及蓝白筛选 (6)挑克隆：2ml 含抗生素的LB (7)提质粒：Kit (8)重组质粒的鉴定：双酶切反应、菌落PCR (9)测序：生物技术服务公司 (10)菌种保存: 20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃
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8
内容
1. 核酸的分离纯化和鉴定: 基因组DNA、总RNA、质粒 2. 基因的克隆与鉴定方法 3. 外源基因转移技术和表达体系 4. 检测方法：电泳技术：agarose、SDS-PAGE
分子杂交: SB、NB、WB、基因芯片技术 DNA序列测定 生物信息学分析技术 5. 基因功能研究的方法 6. 组学研究技术：基因组学、蛋白质组学
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实验一
1. PCR：Pfu, 加A尾；[1208/8:00] 2. Agarose电泳：Goldview染色; [1208] 3. 核酸纯化：凝胶回收Kit; [1208] 4. Agarose电泳：检测回收条带; [1208] 4. 连接反应：pGMT, 22℃ 2h; [1208] 5. 转化：Top10, 热激法，蓝白筛选。 [1208]
实验四
1. SDS-PAGE：10%分离胶；[1215] 2. 转膜：湿转；[1215] 3. 封闭：RT 1h；[1215] 4. Ab1：4 ℃过夜 ；[1215] 5. Ab2：RT 40min ；[1216/8:00] 6. ECL：RT 5min ；[1216]
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7
实验 XXX
1. 设备：加样器 2. 耗材 3. 试剂和配制方法：详细 4. 步骤：详细
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6
实验三
百度文库
1. 转化：BL21, 热激法；[1208] 2. 挑克隆： 2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[1209/9:00] 3. 转接：1%过夜菌+ 2ml 含抗生素的LB , 2管; [1210/8:00] 4. 诱导：0.5mM和0.1mM的IPTG（终浓度）; [1210] 5. 碎菌：超声处理; [1215/8:00] 6. SDS-PAGE：10%分离胶，考兰染色，脱色。 [1215]
ppt课件
12
1962年诺贝尔生理或医学奖
Francis Harry Compton Crick
James Dewey Watson
Maurice Hugh Frederick Wilkins
“发现核酸的分子结构及其对于生命物质信息传递的重要意义”
DNA分子的二级结构
ppt课件
13
5’末端 (游离磷酸基)
特点
数量庞大 dNTP(dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 3’，5’-磷酸二酯键(共价键) 直线形多聚体 方向: 5’---3’ ，5’ CAG….. 3’
3’末端
(游离羟基)
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14
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15
DNA半保留复制
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16
变性与复性
变性：指核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，
实验二
1. 挑克隆：2ml 含抗生素的LB + 1个克隆；[1209/9:00] 2. 提质粒：Kit；[1210/8:00] 3. 重组质粒的鉴定：双酶切反应， 37 ℃ 2h；[1210] 4. Agarose电泳：Goldview染色；[1210] 5. 测序和序列比对：生物技术服务公司； [1213] 6. 菌种保存: 20~30%甘油-LB，-20/-70 ℃。 [1215]
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19
注意事项：
(1) 试剂：pH值准确 (2) 蛋白酶K：20mg/ml， 分装，-20℃，避免反复冻融 (3) 抽提：完全，不要触及蛋白层 (4) 干燥：避免过分 (5) 操作：小心，机械剪切作用，80~100kb
2. 总RNA的分离纯化: 略
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20
3. 质粒：细菌等微生物细胞染色体以外，能独立进行
复制和遗传，赋予宿主细胞一定生物学性状 的共价闭环双链DNA分子。
低。
不涉及共价键断裂，不引起分子量降
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一、核酸的分离、纯化和鉴定
1. 基因组DNA的分离、纯化： PCR、Southern- blot、构建基因组文库
实验材料：哺乳动物组织(50~100mg) 哺乳动物细胞(5x105~107) 六孔板/T25
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18
实验步骤：RT
匀浆：TE pH8.0 组织( 液氮冻存、研磨) 消化：EDTA 、SDS、蛋白酶K、RNase、37℃/55 ℃ 抽提：酚、氯仿、异戊醇 沉淀：异丙醇 / NaAc + 无水乙醇 洗涤：75％乙醇 干燥：风干 溶解：TE / H2O