项目一 免疫血清的制备与提纯

项目一免疫血清的制备与提纯

一、免疫血清的制备

(Preparation of antiserum)

【实验原理】

将适当的免疫原物质注入动物体内，经一段时间动物血清中可出现大量特异性抗体，这种含抗体的血清称为抗血清(或免疫血清)。它在血清学检测中有广泛应用。理想的抗血清的产生主要取决于抗原的纯度和免疫原性，以及动物的应签性。同时免疫接种时的免疫途径、抗原剂量、有无佐剂、注射次数及间隔时间等因素均可影响抗血清的质量。制备的抗血清可直接用于某些实验，也可从中提取特异性抗体或某一组分。

下面介绍几种常用的免疫血清制备方法，免疫动物均选用家兔，这是因为：(1)其产生的血清量足够实验应用并容易驯养；(2)为采血、注射用耳血管很容易找到；(3)用兔子作免疫接种的资料较多，可方便利用；(4)能产生高效价抗体，并且可用常用的沉淀反应、凝集反应或溶血、溶菌反应等试验方法进行鉴定。

【试剂和器材】

1．免疫动物2～3kg健康雄性家兔。

2．免疫原绵羊红细胞(SRBC)、OX19变形杆菌、人IgG(SPA菌体吸附)、正常人混合血清、牛血清白蛋白(BSA)、聚丙烯酰胺凝胶分离的蛋白质抗原。

3．佐剂完全和不完全福氏(Freund)佐剂。

4．其它试剂生理盐水、70%酒精等。

5．器材注射器及针头、棉球、三角烧瓶、玻璃珠、试管、吸管、柯氏瓶(扁瓶)、Luer-lock(双联)注射器、止血钳、手术剪、手术刀等，以上器材均应高压灭菌或消毒后使用；离心机、液体旋转混合器、温箱、水浴箱、冰箱等。

【步骤和方法】

(一)溶血素的制备

1．制备抗原取脱纤维羊血或用阿氏(Alsever)液保存的绵羊红细胞(采血方法见附录常用实验动物采血方法)，用生理盐水洗３次，每次加2～3倍生理盐水，离心2000r/min 10min，弃上清。最后一次按压积用生理盐水配成10%SRBC悬液，放４℃保存备用。

2．免疫动物家兔耳缘静脉注射10%SRBC悬液1ml，间隔3天，连续7次，末次免疫后2周，由耳静脉取血1ml(取血方法见附录常用实验动物采血方法)，分离血清，测定溶血素效价(见补体结合试验)，当效价≥1:2000则可放血收集血清，此法效价可达1:6000~1:10000。

3．分离血清颈动脉放血(见附录常用实验动物采血方法)，用无菌三角瓶收集血液，等血液凝固后立即轻轻剥离(这是获得大量血清的关键步骤)，放室温2~4h，离心2500r/min 10min，收集血清。放4℃过夜虽可获得更多血清，但通常更容易溶血。加入等量甘油，分装，置-20℃保存。

(二)细菌抗血清的制备

1．抗原制备将OX19变形杆菌接种柯氏瓶普通琼脂培养基，37℃培养18~24h，用无菌生理盐水将菌苔洗下，吸到有玻璃珠的无菌三角烧瓶中，加入甲醛使终浓度为0.5%，充分振荡使细菌均匀分散。置4℃24h(或3～5天)杀菌固定，通过无菌试验证实无活菌存在。应用时同麦氏(Mcfarland) 细菌标准比浊管比浊，将菌液用无菌生理盐水稀释到10亿/ml，置4℃备用。

2．免疫动物家兔耳缘静脉注射菌液，第1、6、11天分别注射0.2ml、0.4ml、1.0ml，第18~21天第4次注射，剂量2.0ml。末次免疫注射后7～10天，耳静脉取血收集血清，按直接凝集反应(试管法)滴定血清效价，高于1:2000即可颈动脉放血。否则应追加免疫1~2次，剂量1.0~2.0 ml，间隔期7~10天，若血清效价仍不合格，将家兔废弃，重新选用家兔免疫。

3．分离血清颈动脉放血，收集血清，加入等量甘油，分装，置-20℃保存。

此免疫方法也可用于其它细菌［如伤寒沙门菌H抗原(选用H901菌株)和O 抗原(选用O901菌株)等］抗血清的制备。

(三)人IgG抗血清的制备

1．抗原制备取正常人混合血清1ml，加入10%醛化固定的CowanⅠ株金黄色葡萄球菌悬液4ml，置室温30min，其间混匀3~5次。然后用生理盐水洗7~8次，同麦氏标准比浊管比浊，用生理盐水配成100亿/ml浓度细菌悬液，放4℃备用。

2．免疫动物按表1-1免疫家兔。

表1-1人IgG抗血清制备程序

日期第1天第4天第11天第18天第25天

注射途径皮下多点注射耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉耳缘静脉

抗原剂量(ml) 0.5 0.5 1.0 1.5 2.0 第35天采血用双相免疫扩散法测定抗血清效价，当效价≥1:16时，即可从颈动脉放血收集血清，可加入等量甘油置-20℃保存，也可直接用于提取IgG或特异性抗体。此免疫方法也可用于制备可与SPA结合的许多动物IgG的抗血清。

(四)人全血清免疫血清的制备

1．抗原制备取正常人混合血清，加入等量完全福氏佐剂乳化，乳化完全后即可用于免疫动物。

2．免疫动物第1次背部皮下注射10点，每点0.1ml，共注射加完全福氏佐剂的人全血清1.0ml。2周后(第15天)两侧腹股沟皮下注射人全血清各0.5ml，以后每周按此注射1次，连续3次(前后共5次)，末次注射后采血用双相免疫扩散法测定抗血清效价，当≥1:16时即可颈动脉放血收集血清，加入等量甘油置-20℃保存。可用免疫电泳鉴定抗血清反应特性，应出现4~6条沉淀线。

(五)牛血清白蛋白免疫血清的制备

1．抗原制备取0.4% BSA(如取40mg BSA加10ml生理盐水溶解配制)，加入等量完全福氏佐剂乳化，乳化完全后即可用于免疫注射。

2．免疫动物第1次注射2.0ml加完全福氏佐剂的BSA，注射部位：四足掌0.8ml(每足掌0.2ml)，大腿肌肉0.6ml(每后大腿0.3ml)，颈部皮下0.6ml(每侧0.3ml)，５周后(第36天)大腿肌内注射BSA 1.0ml(每侧0.5ml)。1周后试血用双相免疫扩散法测定，当血清效价≥1:16(可在1:64以上)时，即可放血收集血清，加入等量甘油，置-20℃保存。

(六)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离抗原的免疫血清制备

1．抗原制备

(1)聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，染色，取目的蛋白质斑带(2~3个考马斯亮蓝染色斑带中含10~200μg蛋白质)，弄碎放到含1.5ml蒸馏水或缓冲液的3ml Luer-lock注射器中。

(2)然后将该注射器与另一Luer-lock注射器用一节细管连接起来(不要针头)，来回挤压，直至凝胶被粉碎成均匀细小的碎片。

(3)除去细管，在一支注射器上按上18# 针头，吸入1.5ml完全福氏佐剂。拔去针头，再按上针头连接装置。

(4)将佐剂缓慢吸到有抗原的注射器中，并用细管将注射器连接起来。