真核表达质粒
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(PBS)’ pbs (PBS)’
3’ (U3)’R’(U5)’ U3-R-U5 (PBS) (U3)’R’(U5)’ U3-R-U5 (PBS) 3’ 3’
(PBS)’ U3-R-U5 (PBS) 3’ (PBS)’
(U3)’R’(U5)’
(U3)’R’(U5)’
U3-R-U5 (PBS)
U3-R-U5 (PBS)
Pantropic System
• VSV G(vesicular stomatitis virus glycoprotein): 通过 脂质结合和胞膜融合，介导病毒进入细胞，非细 胞表面受体依赖性的，Pantropic System能转染任 何有丝分裂细胞； • 用携带目的基因载体和VSV G 表达载体共转染 GP2-293细胞，
腺病毒载体（adenoviral vector，Ad）
• 新一代Ad载体为E1/E4或E1/E2缺失体或 去除了Ad的所有结构蛋白只保留Ad的包 装和复制信号（外源DNA容量可达37kb） 序列的Ad，它们的抗原性都较弱。 • 优点：既可以转导静止细胞又可以转导 分裂细胞；重组率罕见；虽然腺病毒感 染常见，但与人的肿瘤发生无关，活病 毒可安全地用于人类疫苗。
U3-R-U5
U3-R-U5
LTR
LTR
Gag Provirus DNA
pol
env Transcription
src
mRNA of Virus Particle
AUG
1
2
3 Deletion
4
Translation Polymeric protein Cleavage Cleavage Cleavage Envenlop protein
产量提高，因为不受调节的AAV Rep78/68的
过表达抑制 rAAV 的产生。
AAV调控序列（2）
• p5 是AAV p19 和 p40启动子的增强子，其作为 cis-acting element，如缺失则造成 p19 和 p40功 能降低。在Cap蛋白编码序列的下游，额外附 加一 p5 拷贝可使p19 和 p40的功能增强， 结果 Rep52/40 和 Capsid 蛋白的表达增多。 • Rep52/40：参与 AAV单链 DNA 的形成，为病 毒包装过程的一部分， 但 capsid 蛋白对病毒 颗粒的装配是必需的。
腺相关病毒载体
（adenoassociated viral vector AAV）
• 为复制缺陷型单链DNA病毒，全长8.5kb， 可感染分裂期和非分裂期细胞，外源DNA 容纳量为4.5kb。 • 感染细胞后进入潜伏期，其基因组DNA 与人第19号染色体DNA整合，当有Ad、 HSV等病毒感染时才能复制，利用AAV细 胞受体硫酸肝素蛋白多糖对重组AAV进行 纯化可以避免Ad蛋白的毒性作用。与Ad 比较，其毒性最小，不引起相关疾病。
由ss RNA产生具有两个LTR的ds DNA过程
r-u5 pbs
R’ (U5)
3’ u3-r3 poly (A)
r-u5 pbs
3’ u3-r3 poly (A)
R’ (U5)
pbs
u3-r3
3’
pbs
pbs (PBS)’
u3-r3 3’ R’(U5)’
u3-r3 3’
(U3)’R’(U5)’
pbs
Amphotropic viruses
• AmphoPack-293分别使用 bleomycin和 puromycin 抗性基因向HEK 293细胞导 入 gag-pol 和 env 基因，因此，可用 neomycin 和 hygromycin为筛选标记， 筛选稳定表达目的基因的高病毒产量的 转基因细胞。
AAV包装质粒
p19 pAAV/Ad p40
p5
ACG
Rap
p19 p40
Cap
pACG-2
p5
ACG p19
Rap
p40
Cap
pXX2
p5Biblioteka ACGRapp40
Cap
p5
p19
pXX2LacZ
p5
Rap
Cap
p5
CMV-LacZ
Production of AAV requires co-infection with Ad to provide essential helper functions
• 两种质粒结合起来能增加 rAAV 产量 40 倍， 并且彻底没有Ad产生的缺陷。
AAV调控序列（1）
• ITR的作用：是 载体DNA复制起始位点、包 装和整合的信号，同时也是 wt AAV 基因表
达的调节因子。
• 将Rep78/68蛋白的原起始密码子ATG突变为
ACG，可以减弱其表达，并因此使 rAAV 的
Amphotropic viruses
• AmphoPack-293 表达 4070A amphotropic 表面蛋白， 其包装病毒能识别 Pit2 受体, 后者在很多种哺乳类动物细胞表达。 • AmphoPack-293 Cell Line 的转染效率高， 病毒滴度106 cfu/ml以上，是理想的瞬时 和稳定产病毒包装细胞系 。
• 逆转录病毒载体和包装细胞系结合起来， 能将重组的逆转录病毒RNA包装成具有 感染性的复制缺陷型病毒颗粒。 • 包装细胞系合成的envelope protein 决定 病毒颗粒的感染范围（tropism）。
Ecotropic 和 Amphotropic viruses
• Ecotropic viruses 利用表达于大鼠和小鼠 细胞表面的 Eco-R receptor 进入细胞。 • Amphotropic viruses 利用表达于许多种哺 乳类细胞表面的Ram-1受体进入宿主细胞。 • PT67 产生 dualtropic envelope 10A1，后 者可利用 Ram- 1和 Glvr-1 两种受体。
The main problems of Ad particle infection
• rAAV 的 产 生 需 要 Ad particle 的 感 染 以 及 rAAV vector and AAV packaging plasmids 的 共转染。 • 需 要 驱 除 Ad particles 的 污 染 ( 用 CsCl2 gradients, column chromgraphy, or heatdenaturing 灭活任何残留的Ad particles) • 在利用病毒基因功能方面AAV and Ad存在竞 争。
基因输送方法（2）
• 阳离子多肽如多聚甘氨酸可以与带负电 荷DNA结合再与细胞表面的特异性配体 如转铁蛋白或胰岛素结合并诱发胞吞作 用，将DNA转运至特异细胞。 • 阳离子脂质可浓缩并将DNA包裹于正电 荷复合体（脂质体）中，由胞吞介导进 入细胞。
基因转移: 逆转录病毒载体
• 该病毒由小鼠白血病病毒（MLV）经过改造 而来，可容纳最长8.0kb的外源DNA序列。在 自然条件下，它不感染人的细胞，但经过包 装的重组病毒能感染人的各种细胞，其RNA 逆转录形成的DNA即原病毒可以稳定地整合 于细胞基因组中，使外源DNA在细胞中得到 长期稳定表达，但其只能转导分裂期细胞， 从而限制了其在非增生细胞如肝细胞、肌纤 维、造血干细胞和神经元等细胞中基因转移 的应用。
ori
基因输送方法（1）
• 非病毒介导的基因输送系统包括裸DNA、 阳离子脂质体、阳离子聚合体。裸 DNA 为含DNA表达框的质粒，可经注射或微 粒炮击（particle bombardment）后直接到 达组织，经胞吞作用或因暂时性膜破裂进 入细胞质并最终至细胞核。 • DNA直接注射法的优点是不引起机体免 疫反应，但与病毒性载体比较起来，其转 基因的表达效率较低。
包装细胞系及其特点
PT67,PA317 Cell type tropism Target cells NIH3T3 dualtropic Broad mammalian 10A1 GALV (Pit1), RAM1 (Pit1) TK ,DHFR 2, NIH3T3 ecotropic Murine, rat EcoPack-293 HEK293 ecotropic Murine, rat AmphoPackGP-293 293 HEK293 HEK293 amphotropic pantropic Broad Mammalian, mammalian nonmammali an 4070A VSV-G RAM1 P-serine, PI, GM3 Bleo puro bleo -
真核表达质粒
• 原核质粒序列：ori，抗性（amp or kana），
MCS。目的在细菌中增殖重组载体。 • 真核表达元件：启动子；终止信号和poly（A）；
剪接信号；复制和选择元件：病毒复制子SV40 和选择标记基因（新-G418，潮-Hyg，嘌呤-Pur）
• 外源DNA序列：起始密码子必须是转录物的第一 个AUG，真核核糖体进行翻译的起始部位的共有 序列（Kozak，1989）：GCCGCCA/GCCAUGG
AUG 1
3
4
AUG 1
4 Translation
Translation
Src protein
Nucleocapsid
+ Reverse transcriptase
逆转录病毒载体的产生（1）
• 为了产生安全而有效基因表达系统，需 要去除逆转录病毒基因组中的有关病毒 复制的基因。 • 将gag、 pol、 env 基因分别稳定地导入 细胞系基因组中，形成病毒包装细胞系。
• 含有VSV G 病毒颗粒结构更稳定，可用 超速 离心进行浓缩，达109 cfu/ml 。
Pantropic System
• VSV-G envelope protein的稳定表达是有 害的，因此用表达VSV-G 的 pVSV-G 瞬 时转染 GP2-293 细胞，可以获得VSV-G 蛋白。 • 这种方法，省时、没有筛选过程，与其 它envelop 蛋白比较起来， VSV-G能增加 膜的稳定性。
逆转录病毒RNA的结构
5’ r u5 3’ r u3 3’ poly (A) 5’ r u5 3’
u3
3’ poly (A)
r
gag 的编码序列在U5序列，但38S mRNA的启动子在U3区 域。只有U3、R-U5形成LTR时，才有38S mRNA的合成。
逆转录病毒的生活周期：整合和转录
逆转录病毒将 ss RNA转变为ds DNA 的过程
envelpe Receptor markers gag-pol Env
Gap70 Mcat-11
Neo hyg
基因转移: 腺病毒载体
• 腺病毒基因组为双链线状DNA，全长36kb， 其病毒颗粒比较稳定，外源DNA在病毒复 制过程中稳定不发生丢失，病毒滴度高， DNA整合于宿主细胞的线粒体。 • 第一代Ad载体是早期蛋白E1、E3缺失突 变体，可容纳7kb的外源DNA，引起机体 强烈的免疫反应
rAAV的产生
• AAV yield: greater than 105 particles/ cell on percell basis。 • rAAV yield: 102-105 particles/cell。 • 包装载体 pXX2 能增加 rAAV yield 15-fold。 • pXX6：含有Ad 基本的辅助基因但缺乏Ad的结 构和复制基因，能起到Ad 的辅助功能。
逆转录病毒载体的产生（2）
• 载体中保留了病毒包装信号（ packaging signal） Y 以及介导病毒的整合、起病毒 启 动 子 和 加 工 的 功 能 的 LTR （ long terminal repeats) 。 • 另外，载体中含有选择标记基因和目的 基因。
逆转录病毒载体的产生（3）
MLP
E1A,B
L1
L2
VA
L3
L4
E3
L5
Ad5
E2A(DBP)
E2B(pol)
E4
pBHG10
pXX5 pXX6
Ad对aav的基础性辅助功能
• E1a: 转录激活因子，对许多Ad基因和aav
的Rep 及 Cap蛋白的转录有上调作用。
• E4: 促进 AAV DNA 的复制
• E4 和 E1b: 促进病毒mRNAs的及时转运。 • E2 和 VA mRNA: 促进病毒 mRNA 的稳定 和有效翻译，尤其对 Cap 转录体。
(0) ori Pcmv i.e. Intron Amp r
pCI-neo
5474 bp
SV40 Late poly (A) f1 ori
Synthetic poly (A) neo
PSV40 e.
rrnBT1T2
BDNF
Ampr
pBV220- BDNF
PRPL 4060 bp
CI ts857
3’ (U3)’R’(U5)’ U3-R-U5 (PBS) (U3)’R’(U5)’ U3-R-U5 (PBS) 3’ 3’
(PBS)’ U3-R-U5 (PBS) 3’ (PBS)’
(U3)’R’(U5)’
(U3)’R’(U5)’
U3-R-U5 (PBS)
U3-R-U5 (PBS)
Pantropic System
• VSV G(vesicular stomatitis virus glycoprotein): 通过 脂质结合和胞膜融合，介导病毒进入细胞，非细 胞表面受体依赖性的，Pantropic System能转染任 何有丝分裂细胞； • 用携带目的基因载体和VSV G 表达载体共转染 GP2-293细胞，
腺病毒载体（adenoviral vector，Ad）
• 新一代Ad载体为E1/E4或E1/E2缺失体或 去除了Ad的所有结构蛋白只保留Ad的包 装和复制信号（外源DNA容量可达37kb） 序列的Ad，它们的抗原性都较弱。 • 优点：既可以转导静止细胞又可以转导 分裂细胞；重组率罕见；虽然腺病毒感 染常见，但与人的肿瘤发生无关，活病 毒可安全地用于人类疫苗。
U3-R-U5
U3-R-U5
LTR
LTR
Gag Provirus DNA
pol
env Transcription
src
mRNA of Virus Particle
AUG
1
2
3 Deletion
4
Translation Polymeric protein Cleavage Cleavage Cleavage Envenlop protein
产量提高，因为不受调节的AAV Rep78/68的
过表达抑制 rAAV 的产生。
AAV调控序列（2）
• p5 是AAV p19 和 p40启动子的增强子，其作为 cis-acting element，如缺失则造成 p19 和 p40功 能降低。在Cap蛋白编码序列的下游，额外附 加一 p5 拷贝可使p19 和 p40的功能增强， 结果 Rep52/40 和 Capsid 蛋白的表达增多。 • Rep52/40：参与 AAV单链 DNA 的形成，为病 毒包装过程的一部分， 但 capsid 蛋白对病毒 颗粒的装配是必需的。
腺相关病毒载体
（adenoassociated viral vector AAV）
• 为复制缺陷型单链DNA病毒，全长8.5kb， 可感染分裂期和非分裂期细胞，外源DNA 容纳量为4.5kb。 • 感染细胞后进入潜伏期，其基因组DNA 与人第19号染色体DNA整合，当有Ad、 HSV等病毒感染时才能复制，利用AAV细 胞受体硫酸肝素蛋白多糖对重组AAV进行 纯化可以避免Ad蛋白的毒性作用。与Ad 比较，其毒性最小，不引起相关疾病。
由ss RNA产生具有两个LTR的ds DNA过程
r-u5 pbs
R’ (U5)
3’ u3-r3 poly (A)
r-u5 pbs
3’ u3-r3 poly (A)
R’ (U5)
pbs
u3-r3
3’
pbs
pbs (PBS)’
u3-r3 3’ R’(U5)’
u3-r3 3’
(U3)’R’(U5)’
pbs
Amphotropic viruses
• AmphoPack-293分别使用 bleomycin和 puromycin 抗性基因向HEK 293细胞导 入 gag-pol 和 env 基因，因此，可用 neomycin 和 hygromycin为筛选标记， 筛选稳定表达目的基因的高病毒产量的 转基因细胞。
AAV包装质粒
p19 pAAV/Ad p40
p5
ACG
Rap
p19 p40
Cap
pACG-2
p5
ACG p19
Rap
p40
Cap
pXX2
p5Biblioteka ACGRapp40
Cap
p5
p19
pXX2LacZ
p5
Rap
Cap
p5
CMV-LacZ
Production of AAV requires co-infection with Ad to provide essential helper functions
• 两种质粒结合起来能增加 rAAV 产量 40 倍， 并且彻底没有Ad产生的缺陷。
AAV调控序列（1）
• ITR的作用：是 载体DNA复制起始位点、包 装和整合的信号，同时也是 wt AAV 基因表
达的调节因子。
• 将Rep78/68蛋白的原起始密码子ATG突变为
ACG，可以减弱其表达，并因此使 rAAV 的
Amphotropic viruses
• AmphoPack-293 表达 4070A amphotropic 表面蛋白， 其包装病毒能识别 Pit2 受体, 后者在很多种哺乳类动物细胞表达。 • AmphoPack-293 Cell Line 的转染效率高， 病毒滴度106 cfu/ml以上，是理想的瞬时 和稳定产病毒包装细胞系 。
• 逆转录病毒载体和包装细胞系结合起来， 能将重组的逆转录病毒RNA包装成具有 感染性的复制缺陷型病毒颗粒。 • 包装细胞系合成的envelope protein 决定 病毒颗粒的感染范围（tropism）。
Ecotropic 和 Amphotropic viruses
• Ecotropic viruses 利用表达于大鼠和小鼠 细胞表面的 Eco-R receptor 进入细胞。 • Amphotropic viruses 利用表达于许多种哺 乳类细胞表面的Ram-1受体进入宿主细胞。 • PT67 产生 dualtropic envelope 10A1，后 者可利用 Ram- 1和 Glvr-1 两种受体。
The main problems of Ad particle infection
• rAAV 的 产 生 需 要 Ad particle 的 感 染 以 及 rAAV vector and AAV packaging plasmids 的 共转染。 • 需 要 驱 除 Ad particles 的 污 染 ( 用 CsCl2 gradients, column chromgraphy, or heatdenaturing 灭活任何残留的Ad particles) • 在利用病毒基因功能方面AAV and Ad存在竞 争。
基因输送方法（2）
• 阳离子多肽如多聚甘氨酸可以与带负电 荷DNA结合再与细胞表面的特异性配体 如转铁蛋白或胰岛素结合并诱发胞吞作 用，将DNA转运至特异细胞。 • 阳离子脂质可浓缩并将DNA包裹于正电 荷复合体（脂质体）中，由胞吞介导进 入细胞。
基因转移: 逆转录病毒载体
• 该病毒由小鼠白血病病毒（MLV）经过改造 而来，可容纳最长8.0kb的外源DNA序列。在 自然条件下，它不感染人的细胞，但经过包 装的重组病毒能感染人的各种细胞，其RNA 逆转录形成的DNA即原病毒可以稳定地整合 于细胞基因组中，使外源DNA在细胞中得到 长期稳定表达，但其只能转导分裂期细胞， 从而限制了其在非增生细胞如肝细胞、肌纤 维、造血干细胞和神经元等细胞中基因转移 的应用。
ori
基因输送方法（1）
• 非病毒介导的基因输送系统包括裸DNA、 阳离子脂质体、阳离子聚合体。裸 DNA 为含DNA表达框的质粒，可经注射或微 粒炮击（particle bombardment）后直接到 达组织，经胞吞作用或因暂时性膜破裂进 入细胞质并最终至细胞核。 • DNA直接注射法的优点是不引起机体免 疫反应，但与病毒性载体比较起来，其转 基因的表达效率较低。
包装细胞系及其特点
PT67,PA317 Cell type tropism Target cells NIH3T3 dualtropic Broad mammalian 10A1 GALV (Pit1), RAM1 (Pit1) TK ,DHFR 2, NIH3T3 ecotropic Murine, rat EcoPack-293 HEK293 ecotropic Murine, rat AmphoPackGP-293 293 HEK293 HEK293 amphotropic pantropic Broad Mammalian, mammalian nonmammali an 4070A VSV-G RAM1 P-serine, PI, GM3 Bleo puro bleo -
真核表达质粒
• 原核质粒序列：ori，抗性（amp or kana），
MCS。目的在细菌中增殖重组载体。 • 真核表达元件：启动子；终止信号和poly（A）；
剪接信号；复制和选择元件：病毒复制子SV40 和选择标记基因（新-G418，潮-Hyg，嘌呤-Pur）
• 外源DNA序列：起始密码子必须是转录物的第一 个AUG，真核核糖体进行翻译的起始部位的共有 序列（Kozak，1989）：GCCGCCA/GCCAUGG
AUG 1
3
4
AUG 1
4 Translation
Translation
Src protein
Nucleocapsid
+ Reverse transcriptase
逆转录病毒载体的产生（1）
• 为了产生安全而有效基因表达系统，需 要去除逆转录病毒基因组中的有关病毒 复制的基因。 • 将gag、 pol、 env 基因分别稳定地导入 细胞系基因组中，形成病毒包装细胞系。
• 含有VSV G 病毒颗粒结构更稳定，可用 超速 离心进行浓缩，达109 cfu/ml 。
Pantropic System
• VSV-G envelope protein的稳定表达是有 害的，因此用表达VSV-G 的 pVSV-G 瞬 时转染 GP2-293 细胞，可以获得VSV-G 蛋白。 • 这种方法，省时、没有筛选过程，与其 它envelop 蛋白比较起来， VSV-G能增加 膜的稳定性。
逆转录病毒RNA的结构
5’ r u5 3’ r u3 3’ poly (A) 5’ r u5 3’
u3
3’ poly (A)
r
gag 的编码序列在U5序列，但38S mRNA的启动子在U3区 域。只有U3、R-U5形成LTR时，才有38S mRNA的合成。
逆转录病毒的生活周期：整合和转录
逆转录病毒将 ss RNA转变为ds DNA 的过程
envelpe Receptor markers gag-pol Env
Gap70 Mcat-11
Neo hyg
基因转移: 腺病毒载体
• 腺病毒基因组为双链线状DNA，全长36kb， 其病毒颗粒比较稳定，外源DNA在病毒复 制过程中稳定不发生丢失，病毒滴度高， DNA整合于宿主细胞的线粒体。 • 第一代Ad载体是早期蛋白E1、E3缺失突 变体，可容纳7kb的外源DNA，引起机体 强烈的免疫反应
rAAV的产生
• AAV yield: greater than 105 particles/ cell on percell basis。 • rAAV yield: 102-105 particles/cell。 • 包装载体 pXX2 能增加 rAAV yield 15-fold。 • pXX6：含有Ad 基本的辅助基因但缺乏Ad的结 构和复制基因，能起到Ad 的辅助功能。
逆转录病毒载体的产生（2）
• 载体中保留了病毒包装信号（ packaging signal） Y 以及介导病毒的整合、起病毒 启 动 子 和 加 工 的 功 能 的 LTR （ long terminal repeats) 。 • 另外，载体中含有选择标记基因和目的 基因。
逆转录病毒载体的产生（3）
MLP
E1A,B
L1
L2
VA
L3
L4
E3
L5
Ad5
E2A(DBP)
E2B(pol)
E4
pBHG10
pXX5 pXX6
Ad对aav的基础性辅助功能
• E1a: 转录激活因子，对许多Ad基因和aav
的Rep 及 Cap蛋白的转录有上调作用。
• E4: 促进 AAV DNA 的复制
• E4 和 E1b: 促进病毒mRNAs的及时转运。 • E2 和 VA mRNA: 促进病毒 mRNA 的稳定 和有效翻译，尤其对 Cap 转录体。
(0) ori Pcmv i.e. Intron Amp r
pCI-neo
5474 bp
SV40 Late poly (A) f1 ori
Synthetic poly (A) neo
PSV40 e.
rrnBT1T2
BDNF
Ampr
pBV220- BDNF
PRPL 4060 bp
CI ts857