色谱理论
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2010-7-18 8
离子交换色谱( 离子交换色谱(ion exchange ~) 利用在离子交换树脂上的交换能力差别. 利用在离子交换树脂上的交换能力差别 . 又可分为: 又可分为: 氨基酸分析( 氨基酸分析(aminoacid analysis) analysis) 离子色谱法( 离子色谱法(ion chromatography) chromatography) 亲合色谱( 亲合色谱(affinity ~) 将生物活性配位基( 将生物活性配位基 ( 酶 , 辅酶 , 抗体等 ) 辅酶, 抗体等) 键合到载体表面形成固定相, 键合到载体表面形成固定相,利用亲合力 大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品) 大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品).
医药色谱理论与实践
主讲教师 姚彤炜,吴永江 姚彤炜,
浙江大学药学院 2006.11 2006.112007.1
2010-7-18
1
教学进度与课程安排
理论教学
时间
06.11.18 06.11.25 06.12.2 06.12.9 06.12.16 06.12.23 自学
2010-7-18
内容
第一章 色谱基础理论 第二章 高效液相色谱法 第三章 手性色谱法 第四章 气相色谱法 第五章 联用技术 第六章 毛细管电泳和离子色谱 第七章 薄层色谱法
21
基线( 基线(base line )——在操作条件下,检 ——在操作条件下,检 测器中只有流动相通过时的流出曲线称为 基线.它反映了仪器的噪音随时间的变化. 噪音(noise 噪音(noise ,N)——各种未知的偶然 ——各种未知的偶然 因素引起的基线起伏的现象称为噪音. 噪音的大小用噪音带的宽度来描述.
2010-7-18 10
GC
填充柱 毛细管柱 柱色谱 经典液相色谱 HPLC 纸色谱法 薄层色谱法 薄膜色谱法
色 谱 法
LC
平面色谱 逆流分配色谱
SFC CEC
2010-7-18
毛细管电色谱 毛细管电泳
11
色谱法特点
具有分离 分析 具有分离,分析功能,可排除组分间的相 分离 分析功能,可排除组分间的相 互干扰,将组分逐个进行定性,定量.发 展快,应用广.
2010-7-18
28
以正构烷烃系列作为量度被测物相对保留值 正构烷烃系列作为量度被测物相对保留值 的标准物.方法如下: 用两个保留时间紧邻待测组分的标准物质来 标定待测物的保留指数(I 标定待测物的保留指数(Ix)
学时
3 8 4 5 3 6 3
2
实验安排
时间
07.1.7
实验内容
GC法: 1,残留溶剂测定 2,药物含量测定 HPLC法: 1,有关物质检查 2,药物含量测定
学时
8
HPLC法: 1,有关物质检查 2,药物含量测定 07.1.14 GC法: 1,残留溶剂测定 2,药物含量测定
8
2010-7-18
3
考试安排
基线漂移
2010-7-18
22
定性参数
保留值 保留时间,保留体积 保留时间,保留体积 相对保留值 保留指数
2010-7-18
23
保留值
保留时间(retention time ,tR)——进样开 ( 始到组分色谱峰顶点时间间隔. 死时间(dead time ,t0或tM)——流动相通 过色谱系统的时间. t0或tM的测定: GC——用空气峰(热导检测)或甲烷峰 (FID)测定 HPLC——溶剂峰前沿出现的时间,或用不 被固定相吸附或溶解的组分,如NaNO2 (210nm测定)的保留时间.
色谱专家系统 是指那些依据人类色谱专家的经验,模拟 思维方式,解决人类色谱专家才能解决的 问题的计算机程序.系统包括:
知识库,推理机,动态数据库,解释子系统, 人机接口和知识获取子系统等.
一般具有:
分离模式推荐, 柱系统或固定相的推荐, 流动相的推荐与优化, 分析结果的解析等.
具色谱专家系统的全自动色谱仪称为智能 色谱仪.
时间 07.1.20 内容 备注 学时 6 讨论与交流 每人1篇实验报 告或经验介绍 (50%) (做PPT) 07.1.21 笔试(50%) 开卷
2
通知:需要参加实验课程的同学,到班长处报名, 交一定费用;若单位有条件或本人对色谱技术比 较熟练的同学可在自己单位实验,然后在交流会 上介绍.
2010-7-18 4
2010-7-18 18
峰的对称性
T=W0.05h/2d1, 或fs=(A+B)/2A T=W /2d1,
W0.05h = x =h/20
h A B
xቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
d1 W0.05h
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19
例1 测得某一物质的色谱峰高为2.55cm, T = 测得某一物质的色谱峰高为2.55cm, 0.575 cm /(2 ×0.285)cm=1. 009 /( 0.285) 则其0.05h=0.6275cm, 则其0.05h=0.6275cm, 量取:W 量取:W0.05h= 0.575cm, 0.575cm, 量取:A= 量取:A= 0.285cm 计算T fs,根据 计算T或fs,根据 T=W0.05h/2d1 h fs=(A+B)/2A A B
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调整保留时间(adjusted retention time, t'R)也称为校正保留时间——某组分由于溶 解或被吸附于固定相,比不溶解或不被吸附 的组分在柱中多停留的时间,即: t'R= tR - t0,在实验条件一定(温度,固定 相), t'R决定组分的性质,故t'R是定性的基 本参数.
第一章 色谱基础理论
概 述
色谱法或称层析法 (chromatography)是一种物理或 chromatography)是一种物理或 物理化学的分离分析方法. 1906年俄国植物学家Tswett M将碳 1906年俄国植物学家Tswett M将碳 酸钙装在竖立的玻璃柱内,从顶端倒 入植物色素的石油醚浸取液,并用石 油醚冲洗,在柱的不同部位形成色带, 油醚冲洗,在柱的不同部位形成色带, 因而命名为色谱法.
2010-7-18
6
色谱法的分类
按流动相与固定相的分子聚集状态分类 按流动相与固定相的分子聚集状态分类 按流动相的分子聚集状态分类 GC, LC,超临界流体色谱(SFC) GC, LC,超临界流体色谱(SFC) 按固定相的聚集状态分类 气相色谱法(气-固,气-液) 液相色谱法(液-固,液-液) 按操作形式分类 操作形式分类 柱色谱,平面色谱,逆流分配
色谱法在药物分析中应用
主要用于成分复杂的样品,如:制剂分析, 主要用于成分 制剂分析, 中成药,天然药物提取分离,合成化合物 纯度,有关杂质分析,残留有机溶剂分析, 残留农药分析,药代动力学,生物利用度, 治疗药浓监测,生物制品药物分析,临床 诊断,法医鉴定等.
2010-7-18 12
色谱法发展
向自动化,联用型,人工智能化方向发展: 色谱-光谱联用
2010-7-18 15
色谱理论
热力学理论——塔片理论 塔片理论 是由平衡的观点来研究分离过程,是一 种半经验理论,以塔片理论为代表. 动力学理论——速率理论 速率理论 是从动力学观点,即速度来研究各种动 力学因素对柱效的影响,以Van Deemeter方程式为代表.
2010-7-18
16
基本概念 色谱峰(peak)——样品产 生的电信号强度对洗脱时间 C 作图.称为流出曲线,浓度 -时间曲线,也称色谱带 (band). 色谱峰有三种形式: 对称峰 拖尾峰(tailing peak) 前延峰(leading peak)
2010-7-18
25
mv tR2 tR1
tR3
t0 进样 t'R1 t'R2 t'R3
2010-7-18 26
time
保留体积( 保留体积(retention volume,VR),又 volume, 称洗脱体积——流动相携带样品进入色谱 称洗脱体积——流动相携带样品进入色谱 柱,由进样开始到某组分在柱后出现浓度 极大值时,通过色谱柱的流动相体积. 极大值时,通过色谱柱的流动相体积. 对于对称峰,V 对于对称峰,VR为样品组分被流动相带 出色谱柱1/2量时所需流动相体积: 出色谱柱1/2量时所需流动相体积: VR = tR Fc Fc为流速(ml/min),Fc一定时,VR Fc为流速(ml/min),Fc一定时,V 与 tR 成正比. Fc大时tR就短,VR与流速 Fc大时t 就短,V 无关. 无关.
气相色谱-付里叶变换红外光谱 高效液相-紫外吸收光谱 气相色谱-质谱(GC-MS) 气相色谱-质谱(GC-MS) 高效液相-质谱( HPLC- MS) 高效液相-质谱( HPLC- MS) 高效液相-付里叶变换红外光谱 超临界流体色谱-质谱 薄层色谱-紫外吸收光谱 毛细管电泳-质谱
2010-7-18 13
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相对保留值( 相对保留值(γ1,2) ——指组分(1)与参照物(2 ——指组分(1)与参照物(2)两者调整 保留值的比值. γ1,2= t'R(1)/ t'R(2) = K1/K2 (K为分配系数) (K为分配系数) 保留指数(I Kovats指数) 保留指数(I,Kovats指数) ——是把组分的保留行为换算成相当于 ——是把组分的保留行为换算成相当于 含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述.
2010-7-18
9
毛细管电色谱( 毛细管电色谱(capillary electro- ~) electro依靠色谱与电场两种作用力, 依靠色谱与电场两种作用力,利用分配 系数和电泳速度差别而分离. 系数和电泳速度差别而分离. 毛细管电泳 (capillary electrophoresis) electrophoresis) 以高压电场为驱动力, 以高压电场为驱动力,根据样品组分的 淌度和分配系数而分离. 淌度和分配系数而分离. 手性色谱( 手性色谱(chiral chromatography) chromatography) 利用手性识别原理, 利用手性识别原理,用于手性药物的分 离分析. 离分析.
x
x = 0.05h
2010-7-18 20
d1 W0.05h
一个色谱峰,可用三项参数来描述: 一个色谱峰,可用三项参数来描述: 峰高或峰面积——定量 峰高或峰面积——定量 峰位(保留值)——定性 峰位(保留值)——定性 峰宽—— 峰宽—— 衡量柱效
峰高(h) tR
2010-7-18
峰面积(A) tR
色谱-色谱联用 指二种色谱方法的联用,也称二维色谱 法.目的是用一种色谱法补充另一种色 谱法分离效果上的不足.常见的有:
气相色谱-气相色谱 高效液相-气相色谱 高效液相-高效液相 高效液相-薄层色谱 二维薄层色谱
色谱-色谱联用法可提高分离效果,获 取更多的定性分析信息.
2010-7-18 14
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色谱法是利用物质在不同的两相中分配, 色谱法是利用物质在不同的两相中分配, 吸附或其他亲和作用的差异,通过多次重 吸附或其他亲和作用的差异,通过多次重 复使微小的差别积累起来变成大的差异, 复使微小的差别积累起来变成大的差异, 从而使混合物中各组分达到分离. 从而使混合物中各组分达到分离. 色谱技术在近三十年中的飞速发展已形成 一门专门的科学,称为色谱学.广泛应用 一门专门的科学,称为色谱学.广泛应用 于各个领域,成为多组分混合物的最重要 于各个领域,成为多组分混合物的最重要 的分离分析方法. 分离分析方法.
2010-7-18
t(min)
17
峰形参数: 对称因子(symmetry factor,fs) ( factor,fs) =(A+B)/2A; fs =(A+B)/2A; 或用: 拖尾因子(tailing factor,T)来衡量 ( factor, T=W0.05h/2d1 T=0.95～1.05(正常峰) T=0.95～1.05(正常峰) T<0.95(前延峰) 0.95(前延峰) T＞1.05(拖尾峰) T＞1.05(拖尾峰)
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按色谱过程的分离机制分类 吸附色谱( 吸附色谱(adsorption ~ ) 利用吸附能力的差别. 利用吸附能力的差别. 分配色谱( 分配色谱(partition ~) 利用分配系数的差别. 利用分配系数的差别. 空间(分子)排阻色谱( 空间(分子)排阻色谱(steric exclusion ~)或称凝胶色谱法(gel ~) 或称凝胶色谱法( 利用被测物分子大小不同而导致的渗透系 数差异. 数差异.
离子交换色谱( 离子交换色谱(ion exchange ~) 利用在离子交换树脂上的交换能力差别. 利用在离子交换树脂上的交换能力差别 . 又可分为: 又可分为: 氨基酸分析( 氨基酸分析(aminoacid analysis) analysis) 离子色谱法( 离子色谱法(ion chromatography) chromatography) 亲合色谱( 亲合色谱(affinity ~) 将生物活性配位基( 将生物活性配位基 ( 酶 , 辅酶 , 抗体等 ) 辅酶, 抗体等) 键合到载体表面形成固定相, 键合到载体表面形成固定相,利用亲合力 大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品) 大小进行分离(专用于蛋白质等生化样品).
医药色谱理论与实践
主讲教师 姚彤炜,吴永江 姚彤炜,
浙江大学药学院 2006.11 2006.112007.1
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教学进度与课程安排
理论教学
时间
06.11.18 06.11.25 06.12.2 06.12.9 06.12.16 06.12.23 自学
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内容
第一章 色谱基础理论 第二章 高效液相色谱法 第三章 手性色谱法 第四章 气相色谱法 第五章 联用技术 第六章 毛细管电泳和离子色谱 第七章 薄层色谱法
21
基线( 基线(base line )——在操作条件下,检 ——在操作条件下,检 测器中只有流动相通过时的流出曲线称为 基线.它反映了仪器的噪音随时间的变化. 噪音(noise 噪音(noise ,N)——各种未知的偶然 ——各种未知的偶然 因素引起的基线起伏的现象称为噪音. 噪音的大小用噪音带的宽度来描述.
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GC
填充柱 毛细管柱 柱色谱 经典液相色谱 HPLC 纸色谱法 薄层色谱法 薄膜色谱法
色 谱 法
LC
平面色谱 逆流分配色谱
SFC CEC
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毛细管电色谱 毛细管电泳
11
色谱法特点
具有分离 分析 具有分离,分析功能,可排除组分间的相 分离 分析功能,可排除组分间的相 互干扰,将组分逐个进行定性,定量.发 展快,应用广.
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28
以正构烷烃系列作为量度被测物相对保留值 正构烷烃系列作为量度被测物相对保留值 的标准物.方法如下: 用两个保留时间紧邻待测组分的标准物质来 标定待测物的保留指数(I 标定待测物的保留指数(Ix)
学时
3 8 4 5 3 6 3
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实验安排
时间
07.1.7
实验内容
GC法: 1,残留溶剂测定 2,药物含量测定 HPLC法: 1,有关物质检查 2,药物含量测定
学时
8
HPLC法: 1,有关物质检查 2,药物含量测定 07.1.14 GC法: 1,残留溶剂测定 2,药物含量测定
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考试安排
基线漂移
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定性参数
保留值 保留时间,保留体积 保留时间,保留体积 相对保留值 保留指数
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23
保留值
保留时间(retention time ,tR)——进样开 ( 始到组分色谱峰顶点时间间隔. 死时间(dead time ,t0或tM)——流动相通 过色谱系统的时间. t0或tM的测定: GC——用空气峰(热导检测)或甲烷峰 (FID)测定 HPLC——溶剂峰前沿出现的时间,或用不 被固定相吸附或溶解的组分,如NaNO2 (210nm测定)的保留时间.
色谱专家系统 是指那些依据人类色谱专家的经验,模拟 思维方式,解决人类色谱专家才能解决的 问题的计算机程序.系统包括:
知识库,推理机,动态数据库,解释子系统, 人机接口和知识获取子系统等.
一般具有:
分离模式推荐, 柱系统或固定相的推荐, 流动相的推荐与优化, 分析结果的解析等.
具色谱专家系统的全自动色谱仪称为智能 色谱仪.
时间 07.1.20 内容 备注 学时 6 讨论与交流 每人1篇实验报 告或经验介绍 (50%) (做PPT) 07.1.21 笔试(50%) 开卷
2
通知:需要参加实验课程的同学,到班长处报名, 交一定费用;若单位有条件或本人对色谱技术比 较熟练的同学可在自己单位实验,然后在交流会 上介绍.
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2010-7-18 18
峰的对称性
T=W0.05h/2d1, 或fs=(A+B)/2A T=W /2d1,
W0.05h = x =h/20
h A B
xቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
d1 W0.05h
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例1 测得某一物质的色谱峰高为2.55cm, T = 测得某一物质的色谱峰高为2.55cm, 0.575 cm /(2 ×0.285)cm=1. 009 /( 0.285) 则其0.05h=0.6275cm, 则其0.05h=0.6275cm, 量取:W 量取:W0.05h= 0.575cm, 0.575cm, 量取:A= 量取:A= 0.285cm 计算T fs,根据 计算T或fs,根据 T=W0.05h/2d1 h fs=(A+B)/2A A B
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调整保留时间(adjusted retention time, t'R)也称为校正保留时间——某组分由于溶 解或被吸附于固定相,比不溶解或不被吸附 的组分在柱中多停留的时间,即: t'R= tR - t0,在实验条件一定(温度,固定 相), t'R决定组分的性质,故t'R是定性的基 本参数.
第一章 色谱基础理论
概 述
色谱法或称层析法 (chromatography)是一种物理或 chromatography)是一种物理或 物理化学的分离分析方法. 1906年俄国植物学家Tswett M将碳 1906年俄国植物学家Tswett M将碳 酸钙装在竖立的玻璃柱内,从顶端倒 入植物色素的石油醚浸取液,并用石 油醚冲洗,在柱的不同部位形成色带, 油醚冲洗,在柱的不同部位形成色带, 因而命名为色谱法.
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色谱法的分类
按流动相与固定相的分子聚集状态分类 按流动相与固定相的分子聚集状态分类 按流动相的分子聚集状态分类 GC, LC,超临界流体色谱(SFC) GC, LC,超临界流体色谱(SFC) 按固定相的聚集状态分类 气相色谱法(气-固,气-液) 液相色谱法(液-固,液-液) 按操作形式分类 操作形式分类 柱色谱,平面色谱,逆流分配
色谱法在药物分析中应用
主要用于成分复杂的样品,如:制剂分析, 主要用于成分 制剂分析, 中成药,天然药物提取分离,合成化合物 纯度,有关杂质分析,残留有机溶剂分析, 残留农药分析,药代动力学,生物利用度, 治疗药浓监测,生物制品药物分析,临床 诊断,法医鉴定等.
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色谱法发展
向自动化,联用型,人工智能化方向发展: 色谱-光谱联用
2010-7-18 15
色谱理论
热力学理论——塔片理论 塔片理论 是由平衡的观点来研究分离过程,是一 种半经验理论,以塔片理论为代表. 动力学理论——速率理论 速率理论 是从动力学观点,即速度来研究各种动 力学因素对柱效的影响,以Van Deemeter方程式为代表.
2010-7-18
16
基本概念 色谱峰(peak)——样品产 生的电信号强度对洗脱时间 C 作图.称为流出曲线,浓度 -时间曲线,也称色谱带 (band). 色谱峰有三种形式: 对称峰 拖尾峰(tailing peak) 前延峰(leading peak)
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25
mv tR2 tR1
tR3
t0 进样 t'R1 t'R2 t'R3
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time
保留体积( 保留体积(retention volume,VR),又 volume, 称洗脱体积——流动相携带样品进入色谱 称洗脱体积——流动相携带样品进入色谱 柱,由进样开始到某组分在柱后出现浓度 极大值时,通过色谱柱的流动相体积. 极大值时,通过色谱柱的流动相体积. 对于对称峰,V 对于对称峰,VR为样品组分被流动相带 出色谱柱1/2量时所需流动相体积: 出色谱柱1/2量时所需流动相体积: VR = tR Fc Fc为流速(ml/min),Fc一定时,VR Fc为流速(ml/min),Fc一定时,V 与 tR 成正比. Fc大时tR就短,VR与流速 Fc大时t 就短,V 无关. 无关.
气相色谱-付里叶变换红外光谱 高效液相-紫外吸收光谱 气相色谱-质谱(GC-MS) 气相色谱-质谱(GC-MS) 高效液相-质谱( HPLC- MS) 高效液相-质谱( HPLC- MS) 高效液相-付里叶变换红外光谱 超临界流体色谱-质谱 薄层色谱-紫外吸收光谱 毛细管电泳-质谱
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相对保留值( 相对保留值(γ1,2) ——指组分(1)与参照物(2 ——指组分(1)与参照物(2)两者调整 保留值的比值. γ1,2= t'R(1)/ t'R(2) = K1/K2 (K为分配系数) (K为分配系数) 保留指数(I Kovats指数) 保留指数(I,Kovats指数) ——是把组分的保留行为换算成相当于 ——是把组分的保留行为换算成相当于 含有几个碳的正构烷烃的保留行为来描述.
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毛细管电色谱( 毛细管电色谱(capillary electro- ~) electro依靠色谱与电场两种作用力, 依靠色谱与电场两种作用力,利用分配 系数和电泳速度差别而分离. 系数和电泳速度差别而分离. 毛细管电泳 (capillary electrophoresis) electrophoresis) 以高压电场为驱动力, 以高压电场为驱动力,根据样品组分的 淌度和分配系数而分离. 淌度和分配系数而分离. 手性色谱( 手性色谱(chiral chromatography) chromatography) 利用手性识别原理, 利用手性识别原理,用于手性药物的分 离分析. 离分析.
x
x = 0.05h
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d1 W0.05h
一个色谱峰,可用三项参数来描述: 一个色谱峰,可用三项参数来描述: 峰高或峰面积——定量 峰高或峰面积——定量 峰位(保留值)——定性 峰位(保留值)——定性 峰宽—— 峰宽—— 衡量柱效
峰高(h) tR
2010-7-18
峰面积(A) tR
色谱-色谱联用 指二种色谱方法的联用,也称二维色谱 法.目的是用一种色谱法补充另一种色 谱法分离效果上的不足.常见的有:
气相色谱-气相色谱 高效液相-气相色谱 高效液相-高效液相 高效液相-薄层色谱 二维薄层色谱
色谱-色谱联用法可提高分离效果,获 取更多的定性分析信息.
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2010-7-18 5
色谱法是利用物质在不同的两相中分配, 色谱法是利用物质在不同的两相中分配, 吸附或其他亲和作用的差异,通过多次重 吸附或其他亲和作用的差异,通过多次重 复使微小的差别积累起来变成大的差异, 复使微小的差别积累起来变成大的差异, 从而使混合物中各组分达到分离. 从而使混合物中各组分达到分离. 色谱技术在近三十年中的飞速发展已形成 一门专门的科学,称为色谱学.广泛应用 一门专门的科学,称为色谱学.广泛应用 于各个领域,成为多组分混合物的最重要 于各个领域,成为多组分混合物的最重要 的分离分析方法. 分离分析方法.
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t(min)
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峰形参数: 对称因子(symmetry factor,fs) ( factor,fs) =(A+B)/2A; fs =(A+B)/2A; 或用: 拖尾因子(tailing factor,T)来衡量 ( factor, T=W0.05h/2d1 T=0.95～1.05(正常峰) T=0.95～1.05(正常峰) T<0.95(前延峰) 0.95(前延峰) T＞1.05(拖尾峰) T＞1.05(拖尾峰)
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按色谱过程的分离机制分类 吸附色谱( 吸附色谱(adsorption ~ ) 利用吸附能力的差别. 利用吸附能力的差别. 分配色谱( 分配色谱(partition ~) 利用分配系数的差别. 利用分配系数的差别. 空间(分子)排阻色谱( 空间(分子)排阻色谱(steric exclusion ~)或称凝胶色谱法(gel ~) 或称凝胶色谱法( 利用被测物分子大小不同而导致的渗透系 数差异. 数差异.