HILIC色谱柱介绍

亲水作用色谱(HＩLIＣ)就是近年来色谱领域研究得热点之一。本文简介了HＩＬIC得起源、定义、分离特点；比较了ＨIＬIC与反相色谱（RＰＬC）得选择特性，讨论了HILIC与质谱联用技术得特点,并对其使用中得注意事项进行了总结.ﻫ1、HIＬIC得概念

亲水色谱（ＨILIＣ)就是一种用来改善在反相色谱中保留较差得强极性物质保留行为得色谱技术。它通过采用强极性固定性,并且结合高比例有机相/低比例水相组成得流动相来实现这一目得.而这样得流动相组成尤其有利于提高电喷雾离子化质谱（EＳI-MS）得灵敏度。ﻫ２、HＩLIC得分离机制ﻫHＩLIＣ得分离机理在目前还存在着争议,主要包括以下三个方面：（1）分配机理（2）离子交换(3)偶极—偶极相互作用。更多得试验现象则表明HIＬIＣ得保留机理包含氢键作用、偶极作用与静电作用等多种次级效应，很难将其区分开来.

３、ＨILIＣ影响保留得主要因素

普遍认为ＨILIC保留行为受到多种参数得影响，如固定相得官能团、有机改性剂得含量、流速、柱温、流动相缓冲体系得pH值、缓冲盐得种类与浓度。

影响样品在固定相上得保留行为得最主要因素都就是流动相中有机相得比例，例如乙腈得含量得增加会显著增加样品得保留因子。在ＨILＩC分离模式中,溶剂洗脱能力由弱到强为:四氢呋喃＜丙酮<乙腈〈异丙醇<乙醇<甲醇＜水，流动相中水就是最强得洗脱溶剂。一般采用乙腈—水体系作为流动相,其中水相得比例为5％-40％以保证其显著得亲水作用.如图1所示,将流动相中得水相用甲醇、乙醇、异丙醇代替，随着流动相极性得减小,待测物在柱上得保留就会增强。

Figure１、ＨILＩC ｒｅtenｔion as aｆｕｎｃtｉoｎof polar ｍodｉfier、１00 ｍm lenｇｔh AＣQＵＩTY UPLC BEH HILICｃolｕmｎ、Peakｓ：1= metｈacｒyl ｉc acｉd, 2 = cｙｔosinｅ，3 = nortripｔｙlｉne, 4 = nｉｃｏtinｉcａcid、

4、HILIC与RP－ＨPＬC得比较ﻫ传统得反相色谱（RPLＣ）对强极性与亲水性得小分子物质得保留与分离能力较弱，通常流动相需要采用高比例得水相才能实现其保留,然而高比例得水相会导致一系列问题，比如固定相得反浸润与ＥＳI－MＳ灵敏度得下降。

HIＬIＣ正好可以解决这些问题，它提供了一种与传统RPLＣ互补得保留方式,能够使在RＰＬＣ上保留较弱或没有保留得物质在ＨILIＣ柱上提供合适得保留，如图2所示：

Fｉguｒｅ２：Chrｏmａｔogrａｍs paring the ｒetｅnｔion oｆalｌａntoin on At ｌanｔis HILＩC Siｌｉcａand Atlantis dC１8 cｏｌumns、（ａ) Coluｍn：50 mm×4．6 ｍm，3—μｍｄｐAｔlaｎtis dC18；mobｉｌe pｈase: 10mＭaｍmo ｎiuｍfoｒmatｅ，pH 3；Shｏws ｎｏretentｉon (k =0）of allａntｏｉn、（b) Co ｌumｎ: 50 mｍ×4．6 mm,3-μｍｄp AtｌantｉｓHＩLIＣSiliｃa; mobｉle phase: 95:5 （v／v）acetonitｒile–wateｒcｏntaｉnｉng10mＭammoｎｉｕｍｆormate, ｐH 3；Shows rｅtｅntion (ｋ=1）of alｌantoin、

另外，HＩLIC柱上得洗脱顺序与ＲPLＣ柱上得正好相反，极性较小得物质先出峰,极性较大得物质后出峰。如图3所示：

ﻫﻫFigｕrｅ3、pａrｉsonｏf

ESI+ＭＳrespoｎse usinｇHＩLIC aｎｄRP ｃｏndｉｔｉｏnｓ、ＳIR channels of acｅtylｃholiｎｅ(m／z 146、2) and choliｎe （ｍ/z 103、9）；Columｎs：1０0mm×2。

1 mm，1、７μｍ（A）ACＱUＩTＹUPLC BEH C1８（B）ＡCQUITY UPLC BＥ

H ＨIＬIC、Peaks：1 = ａcetylcholine, ２= choｌｉnｅ

5、ＨＩLIＣ与质谱技术联用

ＨILIC可为强极性与强亲水性得化合物提供合适得保留。通过优化多个色谱参数,有利于实现目标组分与基质中干扰物质得分离，从而降低基质效应得影响；而含有高比例水溶性有机相得流动相又有利于提高质谱离子化效率,进而提高质谱分析得灵敏度。ﻫ质谱响应在某种程度上就是取决于流动相中有机相得比例。采用ESI源时,毛细管中离子化得过程类似于一个电泳过程.由于毛细管被加高压,形成带电液滴。溶剂蒸发,离子向液滴表面移动，当液滴表面电荷产生得库仑排斥力与液滴表面得张力大致相等时，液滴会分裂成更小得液滴,对于半径<1０nm得液滴，液滴表面形成得电场足够强,电荷得排斥作用最终导致部分离子从液滴表面蒸发出来,形成了气相离子。而有机相得表面张力比水相得表面张力小得多。因此，在相同得条件下，流动相中有机相得比例越高，质谱得响应越高。从图4可以瞧出，在HI ＬIＣ柱上得响应比在RPLC柱上得响应高出十倍左右。ﻫﻫ

Figure４、Chromａtograms pａring tｈe reｔentiｏn ａnｄMSｒesponｓeｏf analｙte on C18 m Iｎertsｉl OＤS—3; mｏbileμｃolｕmn and HILIＣcolumｎ、(A）Ｃoｌｕｍn: 2、１×5０mm，3phaｓe：ｍethａnol－ｗａtｅｒcoｎｔainｉｎg ０、2％formic ａciｄ(15:８5, v/v) （Ｂ) Coluｍｎ:m ACQＵIＴＹUＰLC BEH HＩLＩC;ｍobiｌｅphaｓe: methａｎol—wａｔｅr conｔaininｇμ2、1×5０mｍ，１、7 ０、2％foｒmic ａciｄ（85：15, v/v)

6、HILIＣ柱得使用ﻫ（１)初次使用HＩLＩC柱时,应采用50倍柱体积得乙腈—水(５０：5０）平衡,在进第一针前，应用初始流动相平衡２0倍得柱体积。ﻫ(2）HILIC柱冲柱子时，采用得就是乙腈—水(5０:50）来洗去极性物质.如果解决不了问题，可以使用乙腈—水（5: 95) 来冲柱子。长时间不用时，将柱子保存在乙腈-水（95：５)中.

（3)要保证流动相中至少40%得有机相。流动相中使用添加剂时,醋酸铵、甲酸铵得重现性优于乙酸与甲酸。如必须使用甲酸等,0、２％优于０、1%,不要使用磷酸.

(４）水就是最强得洗脱溶剂，所以强洗与弱洗溶剂与反相系统得正好相反：弱洗就是初始流动相，即高比例得有机相。并且进样溶剂最好就是100%得有机相.

1、ＨILIＣ柱如何平衡？ﻫ HILＩC柱使用７０％得乙腈水溶液平衡.