DNA测序原理.ppt

Sanger双脱氧终止法
• 与 PCR反应类似。
• 反应体系中包含：模板 DNA,
Taq酶, dNTPs, ddNTPs和测 序引物；
• 反应过程：
变性－复性－延伸－终止
Dideoxynucleotides
（双脱氧核苷酸）
• ddNTPs 是反应终止剂 可以当作正常碱基参与复制，一旦链入DNA中， 其后就不能再继续连接。
第六章 DNA序列分析
人类基因组计划(human genome project, HGP)
人类基因组计划(human genome project, HGP)是由美 国科学家于1985年率先提出，于1990年正式启动的。 总体计划在15年内投入至少30亿美元进行人类全基因 组的分析。
美国、英国、法兰西共和国、德意志联邦共和国、日 本和我国科学家共同参与。
基因组测序
完整基因组的测序过程一般包括三个步骤：
（1）建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC（Yeast Artificial Chromosome）克隆、细菌人工染色体BAC （Bacterial Artificial Chromosome）克隆等；
（2）利用鸟枪法（Shotgun Strategy）测定每个克隆的序列；
Sanger第二步：荧光检测 Gel Electrophoresis
DNA Fragment Size Determination
• DNA 带负电
• DNA在电泳胶中的迁移率
与其片段大小有关
除核苷酸序列文本文件外，全自动测序仪还提供曲线图。
Maxam-Gilbert化学裂解法
一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应 分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某 一种或某一类碱基。因此生成一系列放射性标记的 分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生 化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的 DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原 DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺 凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端 标记的分子。
通用引物指导未知序列的测定 引物步移 随机克隆测序 缺失克隆测序
通用引物指导未知序列的测定
根据载体序列设计通用引物测定待测DNA片断
引物步移策略
将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从 DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。
克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了 数据分析工作量。
• 反应体系中dNTPs的浓度远高于ddNTPs(一般3~4 ：
1)。
脱氧核甘酸 与 双脱氧核甘酸 结构比较
少一个－OH
*
H
Sanger第一步：加入复制终止 剂
电 泳 ， 看 谁 跑 得 快
荧光检测探头
ddNTPs参与下的DNA复制
Sanger法测序产物的平均 链长取决于ddNTP与 dNTP的比例，比例高时， 得到较短的产物；
碱基特异性化学切割反应： ➢ 硫酸二甲酯（DMS ）：使DNA分子中鸟
嘌呤（G）上的N7原子甲基化。 ➢ 肼：使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧
啶（C）的嘧啶环断裂；但高盐条件下， 只C断裂，而不与T反应。 ➢ 哌啶：从修饰甲基处断裂核苷酸链。
在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下， 三种化学试剂按不同组合可以特异地切 割核苷酸序列中特定的碱基。
但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序， 才能合成适当的引物进行测序。
定向缺失克隆策略、染色体步查法等。
克隆文库，然后通过通用引物测定每个克隆中的 待测DNA序列。当这些已测序列的数量达到一 定程度后，相当于待测DNA片断的每一部位的 序列也就被测定出来了，通过这些所测序列之间 的重叠部分，最终可将整个DNA片断的序列拼
假基因
基因片段
内含子
源自文库
20~30% 中度至高度重复序列
约60%
串联重复序列/ 成簇重复序列
约40% 分散重复序列
序列测定的技术
经典方法:
Sanger双脱氧链终止法(Sanger,1977) Maxam-Gilbert DNA化学降解法(Maxam &Gilbert,1977)
新技术方法:
➢ 杂交测序法 ➢ 质谱法 ➢ 单分子测序法 ➢ 原子探针显微镜测序法 ➢DNA 芯片法
（3）序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序 列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较， 得到与该序列相关的信息，如基因、调控元件、重复区域等， 进而对序列的生物学特性进行注释。
DNA全序列
切成 小段
小段和载体结合 结合后进行测序
Map fragments
Sequence overlapping fragments
我国承担其中1%的任务，即人类3号染色体短臂上约30亿个碱 基的测序任务。
人类基因组
核基因组(约30亿个碱基)
约10% 基因和基因有关序列
约90% 基因外序列
线粒体基因组
rRNA 基因
tRNA 基因
蛋白编码 基因
专一或中等重复序列
<10%
>90%
70~80%
专一的或低 拷贝数序列
Coding DNA Non-coding DNA
接出来，这样的测序策略称为随机克隆测序。
将DNA大片段切割成小片段的三种方法： 限制性内切酶酶切 超声波处理 DNA酶I降解(加Mn2+)
鸟枪法测序的缺点
➢ 随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量 增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数 据处理分析工作量大。
➢ 高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序 列，导致判断失误。
Sequence all fragments and assemble
Assembled sequence
基因组DNA序列测定示意图
通过随机剪切得到的大分子DNA片段克隆到载体上。绘 制出这些重叠片段的图谱，并对重叠片段进行测序，通过 “拼装”得到基因组序列。另一种方法不是根据片段的染色 体位置，而是根据其重叠部分进行“拼装”。
➢ G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱 落。
➢ G+A反应：酸性条件（如甲酸）可使A和 G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使 A、G脱落。
➢ T+C反应：肼（低盐） ➢ C反应：肼（高盐）
测定DNA长度~250bp。
化学裂解法测定DNA的核苷酸序列
DNA片断序列测定的策略
➢ 测定未知序列的DNA片断 ➢ 一次测序结果有长度限制（﹤1000bp)