最新中国人肥胖基因大肠杆菌中的表达
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中国人肥胖基因序列
肥 胖 基 因 的 原 核 表 达
1 低分子量蛋白质标准 Low molecular protein marker 2 大肠杆菌DH5α E. coli DH5α 3 载体pPROEX Hta转化的DH5α DH5α transfected by vector pPROEX HTa 4，5 重组质粒转化的DH5α DH5α transfected by recombinant plasmid 箭头所指为表达的外源性肥胖基因条带 Arrow indicates the expressed exonic obese gene protein band
中国人肥胖基因大肠杆菌 中的表达
肥胖基因概述及发现
肥胖基因(Obese gene) 是近几年克隆的一个新基因 , 该基因产物 ———瘦
蛋白 (leptin)，是由脂肪组织产生并分泌167个氨基酸组成的多肽 ,分泌蛋白 分子量约16 kb, 是反映体内脂肪组成及体内脂肪含 量和调节体重的重要信 号因子
1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性 基因突变，命名为肥胖基因(Obese gene），它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2 型糖尿病，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠血液循环相连， 肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基 因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆 (Positional cloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，为揭开 肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖 系统，调节体内脂肪含量。实验表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化， 恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用〔4，5〕。
导演：黄富新 主演：
wenku.baidu.com
肥胖基因表达载体构建示意图
运用Trizol试剂得到了非常满意的总RNA，电泳条带显示18s和 28s rRNA分别在1.7kb和4.5 kb位置，比例约为1:2，可见总 RNA完整性和片段大小均很好。根据已知序列设计引物，以中国 人脂肪组织RNA为模板，结果非常特异地扩增出约500bp片段 的肥胖基因条带(下图)。
1 PCR分子量标准 PCR molecular weight marker 2 RT-PCR扩增产物 RTPCR product 箭头所指为肥胖基因条带 Arrow indicates the obese gene band
肥 胖 基 因 的 分 子 克 隆 及 酶 切 鉴 定
1 DNA分子量标准 DNA molecular weight marker 2 重组的pUC19质粒 Recombinant pUC19 plasmid 3 重组的pUC19质粒经EcoR I和BamH I酶切 Recombinant pUC19 plasmid digested by EcoR I and BamH I 箭头所指为肥胖基因条带 Arrow indicates the obese gene band
ATGGT GCCCA TCCAA AAAGT CCAAG ATGAC ACCAA AACCC TCATC AAGAC AATTG TCACC AGGAT CAATG ACATT TCACA CACGC AGTCA GTCTC CTCCA AACAG AAAGT CACCG GTTTG GACTT CATTC CTGGG CTCCA CCCCA TCCTG ACCTT ATCCA AGATG GACCA GACAC TGGCA GTCTA CCAAC AGATC CTCAC CAGTA TGCCT TCCAG AAACG TGATC CAAAT ATCCA ACGAC CTGGA GAACC TCCGG GATCT TCTTC ACGTG CTGGC CTTCT CTAAG AGCTG CCACT TGCCC TGGGC CAGTG GCCTG GAGAC CTTGG ACAGC CTGGG GGGTG TCCTG GAAGC TTCAG GCTAC TCCAC AGAGG TGGTG GCCCT GAGCA GGCTG CAGGG GTCTC TGCAG GACAT GCTGT GGCAG CTGGA CCTCA GCCCT GGGTG CTGA
在有些研究肥胖基因在大肠杆菌 表达中，肥胖基因可在不同大肠 杆菌、不同oD600值、不同时间诱 导等条件下表达，从而可以研究 外源基因在大肠杆菌中的表达量 的效率。
一．实验中我们曾分别用随机引物和P2引物来进行RNA反转录，结果 后者的PCR得率要高得多。测序结果表明运用RT-PCR方法从中国 人脂肪组织获得的肥胖基因序列与Friedman实验组报道的白种人 完全一致，可见该基因在人种间可能没有差异，属于高度保守序列， 在功能上有极其重要的作用。
二．对肥胖基因的原核表达，起初我们将肥胖基因克隆入pBL220原核 表达载体，但未获得表达。后将其克隆入pPROEX HTa六聚组氨 酸融合表达载体，结果获得了高效表达。运用该融合表达载体并可 给产物纯化工作带来便利，只须用相应的亲和层析系统即可达到高 质量的纯化。
三．我们成功完成了中国人肥胖基因的克隆，并通过核苷酸顺序分析 证明中国人肥胖基因和已报道的白种人DNA顺序完全一致。我们 得到的基因可用作探针，用于研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病 人中的表达情况。通过将肥胖基因克隆入原核表达载体，在大肠杆 菌中表达，所得的重组瘦素可用于肥胖症和糖尿病的治疗研究，也 可进一步探讨肥胖基因的作用机制。
肥 胖 基 因 的 原 核 表 达
1 低分子量蛋白质标准 Low molecular protein marker 2 大肠杆菌DH5α E. coli DH5α 3 载体pPROEX Hta转化的DH5α DH5α transfected by vector pPROEX HTa 4，5 重组质粒转化的DH5α DH5α transfected by recombinant plasmid 箭头所指为表达的外源性肥胖基因条带 Arrow indicates the expressed exonic obese gene protein band
中国人肥胖基因大肠杆菌 中的表达
肥胖基因概述及发现
肥胖基因(Obese gene) 是近几年克隆的一个新基因 , 该基因产物 ———瘦
蛋白 (leptin)，是由脂肪组织产生并分泌167个氨基酸组成的多肽 ,分泌蛋白 分子量约16 kb, 是反映体内脂肪组成及体内脂肪含 量和调节体重的重要信 号因子
1783年Lavoisier和Laplace研究表明能量平衡受生理调节。1950年发现了第一个隐性 基因突变，命名为肥胖基因(Obese gene），它是一个单基因突变，导致重度肥胖和2 型糖尿病，但其研究一直进展甚微。动物试验表明将肥胖鼠和正常鼠血液循环相连， 肥胖鼠体重有所下降，提示正常鼠体内有一种因子可控制过度肥胖，而肥胖鼠则因基 因突变而使该因子表达减少或作用丧失。经过8年努力，Friedman实验组运用定位克隆 (Positional cloning)技术，分离得到小鼠的肥胖基因并得到人的同源序列，为揭开 肥胖症之迷及肥胖症的诊治奠定了基础。瘦素作用于下丘脑，控制代谢、能耗和生殖 系统，调节体内脂肪含量。实验表明，重组的瘦素具有使肥胖小鼠代谢和体重正常化， 恢复肥胖基因缺陷小鼠生育能力等活性，而无明显的副作用〔4，5〕。
导演：黄富新 主演：
wenku.baidu.com
肥胖基因表达载体构建示意图
运用Trizol试剂得到了非常满意的总RNA，电泳条带显示18s和 28s rRNA分别在1.7kb和4.5 kb位置，比例约为1:2，可见总 RNA完整性和片段大小均很好。根据已知序列设计引物，以中国 人脂肪组织RNA为模板，结果非常特异地扩增出约500bp片段 的肥胖基因条带(下图)。
1 PCR分子量标准 PCR molecular weight marker 2 RT-PCR扩增产物 RTPCR product 箭头所指为肥胖基因条带 Arrow indicates the obese gene band
肥 胖 基 因 的 分 子 克 隆 及 酶 切 鉴 定
1 DNA分子量标准 DNA molecular weight marker 2 重组的pUC19质粒 Recombinant pUC19 plasmid 3 重组的pUC19质粒经EcoR I和BamH I酶切 Recombinant pUC19 plasmid digested by EcoR I and BamH I 箭头所指为肥胖基因条带 Arrow indicates the obese gene band
ATGGT GCCCA TCCAA AAAGT CCAAG ATGAC ACCAA AACCC TCATC AAGAC AATTG TCACC AGGAT CAATG ACATT TCACA CACGC AGTCA GTCTC CTCCA AACAG AAAGT CACCG GTTTG GACTT CATTC CTGGG CTCCA CCCCA TCCTG ACCTT ATCCA AGATG GACCA GACAC TGGCA GTCTA CCAAC AGATC CTCAC CAGTA TGCCT TCCAG AAACG TGATC CAAAT ATCCA ACGAC CTGGA GAACC TCCGG GATCT TCTTC ACGTG CTGGC CTTCT CTAAG AGCTG CCACT TGCCC TGGGC CAGTG GCCTG GAGAC CTTGG ACAGC CTGGG GGGTG TCCTG GAAGC TTCAG GCTAC TCCAC AGAGG TGGTG GCCCT GAGCA GGCTG CAGGG GTCTC TGCAG GACAT GCTGT GGCAG CTGGA CCTCA GCCCT GGGTG CTGA
在有些研究肥胖基因在大肠杆菌 表达中，肥胖基因可在不同大肠 杆菌、不同oD600值、不同时间诱 导等条件下表达，从而可以研究 外源基因在大肠杆菌中的表达量 的效率。
一．实验中我们曾分别用随机引物和P2引物来进行RNA反转录，结果 后者的PCR得率要高得多。测序结果表明运用RT-PCR方法从中国 人脂肪组织获得的肥胖基因序列与Friedman实验组报道的白种人 完全一致，可见该基因在人种间可能没有差异，属于高度保守序列， 在功能上有极其重要的作用。
二．对肥胖基因的原核表达，起初我们将肥胖基因克隆入pBL220原核 表达载体，但未获得表达。后将其克隆入pPROEX HTa六聚组氨 酸融合表达载体，结果获得了高效表达。运用该融合表达载体并可 给产物纯化工作带来便利，只须用相应的亲和层析系统即可达到高 质量的纯化。
三．我们成功完成了中国人肥胖基因的克隆，并通过核苷酸顺序分析 证明中国人肥胖基因和已报道的白种人DNA顺序完全一致。我们 得到的基因可用作探针，用于研究肥胖基因在肥胖症和糖尿病等病 人中的表达情况。通过将肥胖基因克隆入原核表达载体，在大肠杆 菌中表达，所得的重组瘦素可用于肥胖症和糖尿病的治疗研究，也 可进一步探讨肥胖基因的作用机制。