共聚焦显微镜快速入门

共聚焦显微镜快速入门

占成

Zhancheng@

北京生命科学研究所

共聚焦显微镜历史简介

共聚焦显微镜原理简介

LSM 510 META系统简介 LSM 510 META快速上手 影像中心的管理规定简介

—北京生命科学研究所—

共聚焦显微镜历史简介

—北京生命科学研究所—

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传统显微镜的缺憾

在传统的荧光显微镜中，来自汞灯或者氙灯的激发光照射视野中的全部样品，观察者可以用眼睛直接观察，也可以用CCD等设备直接拍摄荧光图像。 传统显微镜得到的图片

容易受到轴向干扰和侧

向干扰的影响而显得有

些模糊。

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焦点模糊

对于有一定厚度的样品（大于2微米），一方面，由于在物镜聚焦平面上下的平面上也有荧光被激发，焦平面上的荧光图像将有一定的模糊，这被称为轴向（Z）干扰； 另一方面，感兴趣区域的样品也会受到同一焦平面上邻近区域所激发的荧光的干扰，使得图像的对比度降低，这被称为侧向（XY）干扰。

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共聚焦显微镜优势

共聚焦显微镜很好的解决了传统荧光显微镜中焦面模糊的问题，解决了图像的轴向和侧向的干扰。 共聚焦显微镜同时还提

供了光切能力，能对厚

样品（例如花粉颗粒，

果蝇大脑等）进行三维

层切成像。

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共聚焦显微镜发展历史

1955年，Marvin Minsky利用共焦原理搭建了一台共焦显微镜，用来在体观察大脑的神经元网络。

1957年，Marvin Minsky申请了共聚焦显微镜的专利。

1970年，第一台单光束共聚焦激光扫描显微镜问世。

1985年，多个实验室的多篇报道显示共聚焦显微镜可以消除焦点模糊，得到清晰的图像。 1987年，BIO-RAD公司推出了第一台商业化的共聚焦显微镜。

—北京生命科学研究所— 由于目前多数共聚焦显微镜所用光源为激光，

成像方式为逐点扫描成像，因此又被称为“laser scanning confocal microscope ”,“激光扫描共聚焦显微镜”。

激光共聚焦扫描显微镜发展至今，已经不再是普通的光学显微镜，而是光学显微镜与激光，高灵敏度探测器，高性能计算机和数字图像处理软件相结合的新型高精度显微成像系统。

共聚焦显微镜原理简介

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—北京生命科学研究所—共聚焦与传统显微镜的原理差别 照明方式不同：传统显

微镜是一次性照明整个

视野中的样品，因此可

以用眼睛直接观察或者

用CCD获取图像，没有时

间延迟；而共聚焦显微

镜是逐点成像，无法用

眼睛成像，也无法用CCD

获取图像，只能用探测

器收集每个象素点的信

号，再通过软件重构图

象，有一定的时间延迟。

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Pinhole的作用

共聚焦显微镜在探测器

前放置一个pinhole 小孔，

用来阻止非焦面的信号，

同时通过焦面的信号，

以消除焦点模糊。正是

因为pinhole 小孔的存在，

共聚焦显微镜具有了光

切能力，能对厚样品进

行三维层切成像。

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共聚焦的局限

虽然共聚焦显微镜能获取比普通显微镜更清晰的图片，但实际上共焦焦显微镜的分辨率只比普通光学显微镜有少量的提高，普通光学显微镜的分辨率理论极限大约是0.2微米，共聚焦显微镜的分辨率理论极限大约是0.15微米。 共聚焦显微镜的一大限制是成像速度较慢，这限制了其用来研究生物领域中的一些快事件。

LSM 510META系统简介

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系统组成

倒置荧光显微镜

激光器

扫描头

系统控制塔

电脑及显示器

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倒置荧光显微镜Axiovert 200M

Plan-NeoFluar 2.5

Plan-NeoFluar 5X

Plan-NeoFluar 10X

Plan-NeoFluar 20X

Plan-NeoFluar 20X corr ph2

Plan-NeoFluar 40X

Plan-NeoFluar 40Xcorr Ph2 Plan-Apochromat

63X/OIL

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激光器

405nm激光器

Ar离子激光器（458nm，488nm，514nm）

HE-NE绿激光（543nm）

HE-NE红激光（633nm）

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扫描头

2个荧光探测器

一个META 探测器

一个透射探测器

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系统控制塔扫描头控制激光控制

数据通信

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系统功能简介

用作高精度荧光显微镜

获取三维图像 获取多荧光标记图像

—北京生命科学研究所— 时间序列扫描成像，可对样品进行长时间的动态观察，获取样品不同时间的图像。 FRET

实验

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光谱扫描功能，既可

拆分有光谱重叠的不

同染料，也可以获取

未知染料的发射光谱

曲线。