质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展

质粒DNA 纯化及内毒素去除策略研究进展

李卫玲，易初丽∗

（江汉大学

武汉生物医学研究院，湖北武汉430056）摘要：质粒DNA （plasmid DNA ）是最常用的基因工程和基因疫苗载体，近年来在生物医学和环境科学等领域

得到了广泛应用。质粒DNA 纯化是分子生物学研究中常用的实验技术，纳米磁性粒子等固相载体技术和色

谱技术优化了DNA 纯化方法。对大肠杆菌质粒DNA 常用纯化方法、内毒素去除策略以及自动化纯化设备进

行综述，为质粒DNA 的应用研究提供支持。

关键词：质粒DNA ；内毒素；核酸自动纯化仪

中图分类号：Q782文献标志码：A 文章编号：1673-0143（2018）01-0062-05

DOI ：10.16389/42-1737/n.2018.01.012

Progress of Purification of Plasmid DNA and Removal Strategy for Endotoxin

LI Weiling ，YI Chuli ∗

（Wuhan Insititute of Biomedical Sciences ，Jianghan University ，Wuhan 430056，Hubei ，China ）

Abstract ：Plasmid DNA is most common carrier for genetic engineering and gene vaccine ，it is widely applied in biomedical and environmental science in recent years.Purification of plasmid DNA is the common techndogy in molecular biology ，while solid phase carriers such as magnetic nanoparticles and chromatographic techniques have promoted the methods of purification of DNA.We present the methods

of purification of plasmid DNA ，endotoxin removal strategies and automatic nucleic acid purification de⁃

vice which are suited for plasmid DNA isolation ，to privide the supports for application of plasmid DNA.Key words ：plasmid DNA ；endotoxin ；automatic nucleic acid purification device 质粒是染色体外能够自我复制的双链闭合环状DNA 分子，以超螺旋状态存在，几乎完全裸露，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。质粒DNA 广泛应用于基因工程、生物医学的研究以及生物产品的开发和应用。质粒DNA 纯化是其应用的关键步骤，直接影响到转化、测序、PCR 、酶切和转染等下游实验。一般质粒DNA 约为2～20kb ，初步纯化的质粒DNA 构型分为超螺旋、开口环状及线性3种，其中超螺旋结构的质粒DNA 转化和表达效率最高。质粒DNA 安全性好、毒性低和免疫原性较低、便于分离和提取，在DNA 重组技术、转基因方面有广泛应用。

1质粒DNA 常用纯化方法

质粒DNA 分离纯化的方法大致可分为两类：一是传统萃取抽提的液相法，如煮沸法、苯酚氯仿法、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB ）法等；二是固体介质法，如硅胶膜法、阴离子交换膜法及磁珠法

收稿日期：2017-09-06

基金项目：3551光谷人才计划项目（全自动柱式全项核酸纯化仪器的研发及产业化）

作者简介：李卫玲（1989—），女，助理实验师，硕士，研究方向：肿瘤基因治疗。

∗通讯作者：易初丽（1959—），女，教授，研究方向：生物干扰物质的生物医学应用。E-mail ：meiguimoli@

第46卷第1期2018年2月江汉大学学报（自然科学版）J.Jianghan Univ.（Nat.Sci.Ed.）Vol.46No.1Feb.2018

2018年第1期李卫玲，等：质粒DNA纯化及内毒素去除策略研究进展63

等。后者操作步骤简便，提取纯度较好。

1.1硅胶为基础的提取方法

硅胶可以吸附核酸，DNA分子与硅胶表面的相互作用主要包括静电作用、疏水作用、氢键作用等［1］。硅胶或二氧化硅为基础的方法是最常用的提取方法，常应用微孔玻璃、嵌入二氧化硅颗粒的滤膜、硅胶颗粒、二氧化硅构成的藻土型树脂和玻璃纤维［2］。在高浓度的离液盐，如盐酸胍和异硫氰酸胍等条件下，带负电荷的DNA和带正电荷的二氧化硅粒子有很高的亲和力，可用低离子强度的缓冲液或蒸馏水洗脱DNA。目前实验室多用带有硅基质膜的离心柱试剂盒操作。

1.2磁基质为基础的提取方法

磁珠法是利用表面经过硅羟基修钸的复合磁性纳米微球提取核酸［3］，已在生物医学领域中广泛应用。用于核酸纯化的磁性微粒有Fe3O4/SiO2、Fe3O4/SiO2/TiO2等［4］。根据表面修饰基团可分为羟基［5］、羧基［6］、氨基［7］纳米磁珠和多聚乙烯亚胺［8］磁珠。磁珠法可同时处理多个样品，易实现自动化操作，特别适用于微量样本的DNA提取。

1.3阴离子交换为基础的提取方法

阴离子交换膜也常用于分离核酸。基于DNA主链上的带负电荷的磷酸根离子与分子表面上带正电的DEAE等基团之间相互作用，在低pH值及低盐浓度下DNA可与阴离子交换剂结合，可用高pH值及高浓度的盐溶液来洗脱DNA。洗脱的核酸通常需要乙醇或异丙醇沉淀去除盐。阴离子交换柱得到的核酸纯度很高［9］，其缺点是操作繁琐，不适合日常实验要求，常与色谱技术结合，用于超螺旋构型和无内毒素质粒DNA纯化。

2质粒DNA纯化中内毒素去除

常规质粒DNA纯化中，质粒DNA仍需要从55%蛋白质、20%RNA、3%内毒素和3%基因组DNA 中分离［10-11］。其中内毒素又称脂多糖，是革兰阴性菌细胞外膜的主要成分［12］。脂多糖由疏水的脂质A部分、核心寡糖和杂多糖链及菌株特异性O抗原组成，其中脂质A是主要活性位点［13］。在质粒DNA 制备的菌体裂解过程中，内毒素分子被释放到溶菌液中。由于内毒素常形成囊状结构，其分子量、电荷性和疏水性都与质粒DNA相似，常用的纯化方法很难将内毒素与质粒DNA分开。内毒素会降低原代细胞和敏感培养细胞的转染效率，干扰免疫细胞的体外转染。内毒素还会导致机体发热、低血压、呼吸窘迫、血管内凝血及内毒素性休克综合症，内毒素可通过激活TLR4刺激炎症因子IL-1、IL-6、IL-10及TNF-α的合成。国家药监局规定，DNA疫苗制品中内毒素含量不得高于0.01EU/μg，个人用剂量不超过20EU。

内毒素去除策略有两种：一是在质粒DNA结合阶段去除；二是质粒DNA洗脱后去除。目前内毒素的去除方法主要包括非选择性去除，如吸附［14］、超滤［15］和排阻色谱法［16］；选择性沉淀，如采用多粘菌素B［17］、组胺酸类［18］、聚-L-赖氨酸［19］亲和层析；此外，还有疏水作用色谱法［20］和离子交换色谱法［21］。以下介绍几种去除内毒素的方法。

2.1亲和层析法

多粘菌素B（polymyxin-B，PMX-B）是一种环状亲脂性抗生素，有10个氨基酸的多肽，其中7个氨基酸形成环状化合物，在N-端连接一个脂肪链。一般认为多粘菌素B是通过本身的阳离子与内毒素活性部位磷脂A的阴离子相结合［22］，其作用还包括静电作用、离子作用、亲水作用和其他分子之间的相互作用［23］。以PMX-B为配基制成纤维素亲和膜介质，目前主要用于临床血液透析，还可用于内毒素含量检测［24］。

环糊精是环状聚糖，呈管状结构。γ环糊精含8个单糖，内径0.85nm，外侧亲水，内部疏水。脂多糖疏水链距离约0.49nm，环糊精可以包裹脂多糖。由于分子筛效应，环糊精不吸附DNA。通过其他分子共聚修饰，可以提高环糊精吸附效率［25］。

2.2有机试剂萃取法

Triton X-100和Triton X-114是非离子表面活性剂，分子结构中具有亲水的聚乙二醇结构和亲酯的