肿瘤细胞培养成纤维细胞排除法介绍
肿瘤细胞培养成纤维细胞排除法介绍
1．机械刮除法：
是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热
烧灼器刮除）。刮除程序为：
（1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细
胞的部位；
（2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；
（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；
（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除
至完全除掉为止
2．反复贴壁法：
根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清
的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。
（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hank
s 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；
（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。
置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后
慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全
培养液置温箱中继续培养；
（4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培
养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。
当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次
日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为
癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。
3．消化排除法：
此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞
一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不
时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置
温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后，
成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维
细胞除净。
4．胶原酶消化法：
本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；
（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净
肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。
5．其它方法：
有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖
制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中 800g离心 10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1. 050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特
殊化学物如 SOD抑制成纤维细胞生长的方法。
选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的
条件，才能获得好的效果。
细胞转染
报告基因(reporter gene)是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，是一个其表达产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列相融合形成嵌合基因，或与其它目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选得到转化体。 作为报告基因，在遗传选择和筛选检测方面必须具有以下几个条件：(1)已被和全序列已测定；(2)表达产物在受体细胞中不存在，即无背景，在被转染的细胞中无相似的内源性表达产物；(3)其表达产物能进行定量测定。 在植物基因工程研究领域，已使用的报告基因主要有以下几种： 胭脂碱合成酶基因(nos)、章鱼碱合成酶基因(ocs) nos、ocs这两个基因是致瘤土壤农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)的Ti质粒特有的，对Ti质粒进行改造，用相应的致瘤农杆菌转化植物体时，如果外源基因转入植物体中，则这两种报告基因在植物根茎叶中均能表达，不受发育调控，检测时直接用转化体提取液进行纸电泳，染色后在紫外光下观察荧光即可。 新霉素磷酸转移酶基因(nptⅡ)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat) nptⅡ、cat及庆大霉素转移酶基因，均为抗生素筛选基因，相关的酶可以对底物进行修饰(磷酸化、乙酰化等)，从而使这些抗生素失去对植物生长的抑制作用，使得含有这些抗性基因的转化体能在含这些抗生素的筛选培养基上正常生长，也可以用转化体提取液体，外用同位素标记，放射自显影筛选转化体。氯霉素乙酰转移酶基因测时可通过放射自显影观察。 荧光素酶基因（luciferase Gene）
1985年从北美荧火虫和叩头虫cDNA文库中出来的，该酶在有ATP、Mg2＋、O2和荧光素存在下发出荧光，这样就可用植物整株或部分直接用X-光片或专门仪器进行检测。具有检测速度快、灵敏度比cat基因高30～1000倍、费用低、不需使用放射性同位素等优点，得到了广泛的采用。 β-D-葡萄糖苷酶基因 该酶催化底物形成β-D-葡萄糖苷酸，它在植物体中几乎无背景，组织化学检测很稳定，可用分光光谱、荧光等进行检测。 除此之外还有庆大霉素转移酶基因等。 在动物基因表达调控的研究中，已使用的报告基因主要有以下几种： 绿色荧光蛋白（gfp）基因等。 绿色荧光蛋白来源于海洋生物水母，其基因可在异源组织中表达并产生荧光，GFP Cdnad 开放阅读框架长度约740bp，编码238个氨基酸残基，其肽链内部第65-67位丝氨酸－脱氢酪氨酸－甘氨酸通过自身环化和氧化形成一个发色基因，在长紫外波长或蓝光照射下发出绿色荧光。转染后的细胞可在荧光显微镜或流式细胞仪(FACS)中直接观察基因的表达。 此外还有β-半乳糖苷酶基因、二氢叶酸还原酶基因、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)等。 荧光检测器是一种专用型检测器，灵敏度在目前常用的HPLC检测器中最高，在HPLC中应用较多。仅次于紫外吸收检测器。它用于能激发荧光的化合物。 工作原理是：用紫外光照射某些化合物时它们可受激发而发出荧光，测定发出的荧光能量即可定量。很多与生命科学有关的物质，如氨基酸、胺类、维生素、甾族化合物及某些代谢药物都可以用荧光法检测。荧光检测器在生物样品痕量分析中很有用，尤其在用荧光衍生剂后，可以检测很微量的氨基酸和肽。
成纤维细胞的培养
成纤维细胞的培养 1前言 成纤维细胞（fibroblast）是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型：成纤维细胞乃是功能活动旺盛的细胞。 成纤维细胞是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位[1,2]。 成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍[3]。 2材料和方法 2.1材料 玻璃器材：细胞培养瓶、500ml盐水瓶、青霉瓶、刻度吸管 塑料器材：细胞培养板 橡胶器材：细胞培养瓶胶塞、青霉素瓶塞、翻口胶塞和胶管 滤器；玻璃漏斗、微孔滤膜 2.2试剂的配制 水、0.4%酚红液、Hank’s液、MEM、无钙PBS液、双抗的配制、NaHCO3配制、新生犊牛血清（FCS)、原代和传代细胞分散液、3％谷氨酰胺、细胞生长液和细胞维持液、其他液体；洗液、无钙PBS胰酶液、Hank's液、 2.3方法 2.3.1试剂配制 （1）细胞分散液：无钙胰蛋白酶加4倍无菌蒸馏水 （2) 组织冲洗液：无血清MEM （3）细胞生长液：含10％FCS MEM 2.3.2实验分配：每人1枚鸡胚，每人制备1瓶100mL培养瓶细胞。 2.3.3细胞制备过程 碘酊消毒气室处蛋壳，去除蛋壳，撕开壳膜、尿囊膜和羊膜，取出鸡胚，用无血清MEM 冲洗3次，将鸡胚置于无菌平皿内，去除头、四肢和内脏，并将胚体置于另一个平皿内，用无血清MEM冲洗3次，剪碎胚体，静止片刻，吸净上清，加入5－10倍无钙胰蛋白酶，并吸入于无菌青霉素小瓶内，用橡皮膏封严瓶口，37 ℃消化至细胞呈毛球样，吸净消化液，加入细胞生长液，将细胞置于细胞培养瓶中，并用大口吸管吹打细胞使之充分分散，分装2个细胞培养瓶内。 4、换液或接毒 细胞于37℃培养过夜，次日换细胞维持液，或单层接种病毒，每日观察CPE。
细胞系或细胞株的建立
、概念、概念 1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。 2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。 二、建立细胞系（或株）的要求 什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明： 1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物； 个体性别、年龄；取材的器官或组织。 如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。 2、细胞生物学检测： 了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。 如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。 3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。 三、若干细胞建株的要点及基本过程 （一）肿瘤细胞培养技术要点 1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组织。 2、成纤维细胞排除：在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻以至消失，应仔细排除。 排除方法常有：机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。 3、提高肿瘤细胞培养存活率和生长率 根据实验经验，肿瘤细胞在体外不易培养，建立能传代的肿瘤细胞系更为困难。一般当肿瘤组成或细胞被原代培养后，要经过对新环境的适应才能生长，因此不能局限于一般培养法，须采用一些特殊措施。如：用适宜底物，鼠尾胶原底层及饲细胞底层等。用细胞生长因子，根据细胞种类不同选用不同的促细胞生长因子，如胰岛素、氢化可的松，雌激素等。也可以考虑动物媒介培养。 （二）人类淋巴母细胞建株方法 l、4ml肝素抗凝血于离心管中，加入2ml RPMI 1640。 2、混匀后沿管壁缓慢加到预置有4ml淋巴细胞分离液的液面上静置30min。 3、1500rpm，15min，吸取白细胞层（第二层）于另一离心管中。 4、加RPMI 1640 5ml洗涤白细胞两次。 5、将白细胞接种至1ml RPMI 1640培养基中，加入10μl环胞霉素和100μl的EBV（EB病毒）液，混匀。 6、水浴摇床，40次/分，37℃，3hr。 7、1500rpm，15min。将细胞接种至1ml培养基中（内含谷氨酰胺1mM／ml）加入10μl环胞霉素，轻轻混匀，37℃培养。 8、5天后观察细胞转化和生长情况，决定是否半量换液。一般半量换液l—2次，并维持环胞霉素的浓度。
肿瘤细胞培养成纤维细胞排除法介绍
肿瘤细胞培养成纤维细胞排除法介绍 1．机械刮除法： 是用不锈钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用（也可用特制电热 烧灼器刮除）。刮除程序为： （1）标记：镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细 胞的部位； （2）刮除：弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间； （3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞； （4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除 至完全除掉为止 2．反复贴壁法： 根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清 的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。 （1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hank s 冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液； （2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。 置温箱中静止培养5～20分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后 慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全 培养液置温箱中继续培养； （4）培养B瓶中细胞5～20分钟后，接处理A的方法，把培养液注入C培 养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。 当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。如操作成功，次
日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为 癌细胞。必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。 3．消化排除法： 此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是： （1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培养细胞 一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下窥视和不 时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化； （2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置 温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。用此法处理后， 成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落。经过几次反复处理，可能把成纤维 细胞除净。 4．胶原酶消化法： 本法是利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下窥视，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化； （2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净 肿瘤细胞。如成纤维细胞未被除净，可再次重复。 5．其它方法： 有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖 制备成比重1.025～1.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23℃中 800g离心 10分种。在比重1.025～1.050层为成纤维细胞，在比重1. 050～1.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。最近也有人应用特 殊化学物如 SOD抑制成纤维细胞生长的方法。 选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的 条件，才能获得好的效果。
肿瘤相关成纤维细胞的分类-概述说明以及解释
肿瘤相关成纤维细胞的分类-概述说明以及解释 1.引言 1.1 概述 概述： 肿瘤相关成纤维细胞是一类紧密参与肿瘤发展和进展的细胞群体，其在肿瘤的生长、侵袭、转移和治疗抵抗等方面发挥着重要的作用。成纤维细胞是一种基质细胞，主要分布在结缔组织中，具有合成胶原蛋白、细胞外基质和调节炎症反应等功能。在肿瘤发展过程中，肿瘤相关成纤维细胞能够与癌细胞相互作用，促进肿瘤的增殖、侵袭和血管生成，同时也能够影响免疫细胞的功能，降低机体对肿瘤的抵抗能力。 随着对肿瘤微环境的研究不断深入，对肿瘤相关成纤维细胞的研究也逐渐受到重视。成纤维细胞的异质性和功能多样性是研究的重点之一。肿瘤相关成纤维细胞可以分为多个亚型，根据其表型、功能和来源等特征进行分类。通过对肿瘤相关成纤维细胞的分类和研究，可以更好地认识其在肿瘤中的作用机制，并为肿瘤的诊断、治疗和预后评估提供新的思路和方法。 本文将对肿瘤相关成纤维细胞的分类进行详细的阐述和总结。首先，将介绍成纤维细胞的定义和功能，为后续内容的理解奠定基础。然后，将
重点探讨成纤维细胞在肿瘤发展中的作用，包括其对肿瘤增殖、侵袭、转移和血管生成的影响等方面。最后，将详细介绍不同类型的肿瘤相关成纤维细胞的分类方法，并探讨其在肿瘤研究和临床应用中的意义和潜力。 通过对肿瘤相关成纤维细胞的分类的深入研究，有助于我们更好地认识肿瘤的发生和发展机制，为肿瘤的个体化治疗提供新的思路和方法。同时，通过针对特定类型的肿瘤相关成纤维细胞的干预，可以实现对肿瘤微环境的调控，达到更好的治疗效果。因此，对肿瘤相关成纤维细胞的分类研究具有重要的理论和实践意义。 1.2文章结构 1.2 文章结构 本文将依次介绍肿瘤相关成纤维细胞的分类。首先，引言部分将提供一个概述，简要介绍成纤维细胞在肿瘤发展中的重要作用，并阐述文章的目的。接下来，正文部分将分为两个主要部分。第一部分将定义和说明成纤维细胞的功能，包括其在正常生理状态下的作用，以及在肿瘤发展中的特殊功能。第二部分将深入探讨成纤维细胞在肿瘤发展中的作用，包括其对肿瘤细胞生长、侵袭和转移的影响。最后，结论部分将详细介绍不同类型的肿瘤相关成纤维细胞的分类，并探讨分类的意义和应用价值。 1.3 目的 本文的目的是探讨肿瘤相关成纤维细胞的分类。通过深入了解成纤维
肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法-概述说明以及解释
肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法-概述说明以及解释 1.引言 【1.1 概述】 本文旨在介绍肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法。肿瘤是一种常见的疾病，对人类健康产生了极大的威胁。成纤维细胞作为一种重要的细胞类型，对肿瘤的发生和发展起着重要的调节作用。因此，准确鉴定肿瘤相关成纤维细胞对于深入研究肿瘤的发病机制以及寻找新的治疗策略具有重要意义。 本文将首先介绍成纤维细胞的重要性，包括其在正常生理条件下的维持组织结构和功能的作用，以及在肿瘤中的调节效应。接着，将详细介绍目前已经发展出的肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法，包括基于细胞表面标记物的鉴定方法、基于转录组学的鉴定方法以及基于细胞功能的鉴定方法。每种方法都有其特点和优劣势，因此深入了解这些方法对于进行准确的成纤维细胞鉴定具有重要意义。 最后，文章将总结目前的研究进展，指出肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法在临床治疗和预后评估中的应用前景，并展望未来可能的研究方向。通过本文的介绍，希望能够增加研究人员对于肿瘤相关成纤维细胞的认识，并为肿瘤的个体化治疗提供新的思路和方法。
总之，本文将以概述的方式介绍肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法，旨在促进对肿瘤发生发展机制的深入理解，为肿瘤的精准诊疗提供新的思路和策略。 1.2 文章结构 文章结构部分的内容可以是： 文章结构： 本文分为引言、正文和结论三个部分。引言部分旨在概述本文的内容和目的，并介绍了肿瘤相关成纤维细胞鉴定方法的重要性。正文部分主要包括成纤维细胞的重要性和肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法。结论部分对本文进行了总结，并展望了未来可能的研究方向。 引言部分的概述主要介绍了成纤维细胞在生物体内的重要性。成纤维细胞是一种常见的真核细胞类型，广泛存在于不同组织和器官中，对于维持组织结构的稳定和修复起着重要作用。然而，肿瘤相关成纤维细胞的功能和特性与正常成纤维细胞存在差异，其在肿瘤发生、发展和治疗中具有重要的调节作用。因此，准确鉴定肿瘤相关成纤维细胞是探索肿瘤发展机制和开展有效治疗策略的基础。 正文部分将详细介绍肿瘤相关成纤维细胞的鉴定方法。这些方法包括但不限于免疫组化染色、基因表达谱分析、细胞功能实验等。通过这些方
肝内胆管细胞癌相关成纤维细胞的分离、纯化及鉴定
肝内胆管细胞癌相关成纤维细胞的分离、纯化及鉴定 杨柳晓;高强 【摘要】目的:探讨肝内胆管癌相关成纤维细胞(iCAFs)的分离、纯化和鉴定方法, 为后续研究奠定基础.方法:在无菌条件下,留取肝内胆管细胞癌(iCCA)组织标本,充分剪碎后置入含Ⅳ型胶原酶和透明质酸酶的消化液中恒温振荡,将所得的单细胞悬液 进行免疫磁珠分选纯化,分离出肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)并培养.通过观察细胞形态,并经免疫荧光和流式细胞仪测定,鉴定其是否为iCAFs.结果:iCAFs呈长条形或纺锤形,胞质透明,折光明显,胞核单个、呈圆形或卵圆形,细胞突起相互交错重叠形成网格状排列、密集时呈现“峰-谷”样表现;免疫荧光检测显示,α平滑肌肌动蛋白(+)、波形蛋白(+)、复合型角蛋白抗体(一);流式细胞仪检测示,α平滑肌肌动蛋白(+),同 时CD34和CD45均为(一).结论:酶消化法联合免疫磁珠分选可有效分离出高纯度 的iCAFs,为进一步研究iCAFs的相关功能研究提供了良好的平台. 【期刊名称】《中国临床医学》 【年(卷),期】2016(023)002 【总页数】5页(P131-135) 【关键词】肝内胆管细胞癌;肿瘤相关成纤维细胞;分离;鉴定 【作者】杨柳晓;高强 【作者单位】复旦大学附属中山医院重症医学科,上海200032;复旦大学附属中山 医院肝外科,上海200032 【正文语种】中文
【中图分类】R735.9 肿瘤微环境中的成纤维细胞被活化后可以通过自分泌和(或)旁分泌途径为上皮提供促癌信号、参与肿瘤血管的形成，促进肿瘤侵袭转移[1]。这类具有特殊表型及功能、存在于肿瘤间质中的成纤维细胞群即被称为肿瘤相关成纤维细胞(carcinoma-associated fibroblasts, CAFs)。研究[2]证实，CAFs的聚集和活化可以影响多种 实体肿瘤的发生、发展及侵袭。肝内胆管细胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)是一种具有丰富间质成分的原发性肝癌，其肿瘤间质中富含的CAFs与肝内胆管细胞癌的发生发展密切相关[3]。为能进一步研究iCCA 相关成纤维细胞(iCAFS)的生物学特性和影响肿瘤的机制，原代iCAFs的分离纯化和培养扩增是必要的。目前国内外对CAFs的分离主要采用组织块贴壁法和酶消化法。本研究采用酶消化法联合免疫磁珠分选进行原代iCAFs的分离、纯化及培养，证实具有可重复性及高纯度获得iCAFs的优势，有助于后续实验的进行，现报告 如下。 1.1 主要仪器及试剂Ⅳ型胶原酶购自美国Invitrogen公司、透明质酸酶和牛血清蛋白(BSA)购自美国Sigma公司；胎牛血清(FBS)、高糖DMEM培养液、0.25%胰蛋白酶、双抗(青霉素、链霉素100 mg/L)、1×磷酸盐缓冲液(PBS)等购自美国Gibco公司；免疫组化及免疫荧光抗体α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、波形蛋白(vimentin)、复合型角蛋白抗体(pan-CK)购自英国Abcam公司，4’,6-二脒基- 2-苯基吲哚(DAPI)和二抗购自上海碧云天生物技术有限公司；流式细胞实验用α-SMA-FITC、CD34-PE和CD45-APC抗体购自美国R&D公司；免疫磁珠分选仪及anti-fibroblast MicroBeads试剂盒(130050601)购自德国美天旎生物技术有 限公司。 1.2 标本来源及采集用于原代分离的肿瘤标本来自iCCA根治性切除的患者。 在标本手术切除离体后15 min内，用无菌手术刀片切取体积大于1 cm3的组织
人肿瘤细胞培养的原理
人肿瘤细胞培养的原理 人肿瘤细胞培养是指将来自人体中的肿瘤组织或细胞分离、培养和保存的过程。这种细胞培养技术不仅在医学研究领域具有重要意义，也被广泛地应用于药物筛选、毒性测试及疾病模型的构建等领域。人肿瘤细胞培养的原理主要包括以下几个方面： 1. 肿瘤细胞的分离和培养基的选择：首先从人体肿瘤组织中获得细胞，通常采用手术、活检或穿刺等方法取得。然后将组织样本经过切碎、消化酶处理等步骤，使其中的细胞得以分离。根据所选细胞类型的不同，可以选择适当的培养基来维持细胞的生长、增殖和功能维持。常用的培养基包括DMEM （Dulbecco's Modified Eagle Medium，杜尔贝科修正鹰鳝培养基）、RPMI 1640（Roswell Park Memorial Institute 1640）、F12（Ham's F-12鹰鳝培养基）等。 2. 细胞的传代：肿瘤细胞培养的过程中，细胞会经过一系列的传代过程。一般情况下，初始细胞数较少的细胞会在培养基中进行扩增，达到一定的细胞数量后，需要进行传代。传代是将已经增殖的细胞在一个新的培养器中继续培养的过程。传代过程需要注意，细胞的数目、培养基的成分和细胞培养器的选择等因素都会影响细胞的传代效果。 3. 培养条件的优化：为了使肿瘤细胞在体外更好地生长和繁殖，需要优化培养条件。这包括培养基的配方、温度、pH值、气体组成等因素的调整。培养基
中通常会添加适当的营养物质，如氨基酸、脂类、维生素和微量元素等，以满足细胞的生长需求。同时，细胞培养过程中需要保持适当的温度和湿度，通常将温度维持在37，湿度维持在95％以上。还需要提供合适的气体环境，如5％CO2 /空气混合体，以维持细胞生长所需要的适宜pH值。 4. 检测细胞的纯度和活力：细胞培养过程中，需要定期检测细胞的纯度和活力。细胞的纯度是指细胞中肿瘤细胞的比例，可以通过免疫细胞化学、流式细胞术等方法进行检测。细胞的活力是指细胞的生长状况和功能状态，可以通过细胞墨普杂染、MTT法等方法进行检测。这些检测有助于确定培养条件是否适当，是否需要进行细胞分离和传代。 5. 细胞的保存和冻存：为了方便后续的实验操作和长期保存，肿瘤细胞还可以进行冻存。冻存技术通常使用含有细胞保护剂（如DMSO、甘油等）的培养基将细胞冷冻保存在低温下。常用的冷冻保存温度为-196C（液氮温度），在此温度下，细胞的代谢率降低，可以保证细胞长时间保存并保持其功能和性状。 总的来说，人肿瘤细胞培养是通过将分离的肿瘤细胞放置在适宜的培养基中，并提供合适的培养条件，使细胞能够在体外持续生长和增殖。这种细胞培养技术为了解肿瘤细胞的生物学特性、研究其生长调控机制以及开发抗肿瘤药物等都提供了重要的工具和平台。
肿瘤细胞培养
肿瘤细胞培养 肿瘤细胞培养是医学研究中重要的实验手段之一，它可以提供大量的肿瘤细胞用于进一步的研究。本文将介绍肿瘤细胞培养的基本步骤和技术要点。 一、肿瘤细胞培养的基本步骤 1. 细胞准备：选择合适的肿瘤细胞株，并从冷冻保存状态中复苏。确保培养皿和培养试剂的无菌，准备培养基以提供适宜的细胞生长环境。 2. 细胞接种：将肿瘤细胞接种到培养皿中，控制接种密度和接种体积，使细胞能够充分附着并快速扩增。 3. 细胞培养：将接种成功的细胞放置于恒温培养箱内，提供适宜的培养条件（如温度、湿度和二氧化碳浓度等），定期更换培养基以维持细胞的正常生长。 4. 细胞观察：定期观察和记录细胞的生长情况，包括细胞数目增长趋势、细胞形态和细胞的附着情况等。 5. 细胞传代：当细胞密度达到一定程度时，需进行细胞传代以避免细胞因长时间培养而导致的突变或凋亡。传代时需要使用胰蛋白酶等相关试剂进行细胞的离析和分散。 二、肿瘤细胞培养的技术要点
1. 培养基选择：不同类型的肿瘤细胞对培养基的要求有所不同，因 此应选择适宜的培养基。一般情况下，培养基中应包含足够的营养物 质和生长因子，同时控制培养基的pH值和温度。 2. 细胞密度控制：细胞密度对于细胞生长和代谢活性具有重要影响。过高的密度会导致细胞周围缺氧和养分不足，过低的密度则无法维持 细胞生长。准确控制细胞密度可以提高细胞培养的成功率和生长速度。 3. 细胞消毒：细胞培养过程中，细胞容易受到外界的污染。因此， 在进行细胞接种和传代时，需要严格遵守消毒操作规范，使用无菌器 材和试剂，并且定期对培养箱和操作台进行消毒。 4. 细胞分化和标志物检测：某些肿瘤细胞在培养过程中可能会发生 分化现象，失去肿瘤特性。因此，需要进行细胞的标志物检测，以确 保细胞仍保持原始的肿瘤细胞特征。 5. 质量控制和质量保证：肿瘤细胞培养需要严格遵循实验室的规范 操作流程，并进行质量控制和质量保证。细胞培养过程中应定期检测 培养皿和培养基的无菌性，避免外界因素对实验结果的干扰。 三、结语 肿瘤细胞培养作为医学研究的重要工具，对于深入了解肿瘤细胞的 生物学特性和疾病机制具有重要意义。通过合理控制培养条件和精确 操作，可以获得高质量的肿瘤细胞用于相关研究。希望本文所介绍的 肿瘤细胞培养的基本步骤和技术要点能够对相关科研人员提供帮助。
肿瘤细胞的原代培养方法(组织块法、酶消化法、钽网法与脱落细胞
肿瘤细胞的原代培养方法（组织块法、酶消化法、钽网法与脱落细胞 肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用RPMI、DMEM、M cCoy-5A等培养基，血清浓度不高，10%即可，建议最好在原代培养时 能加入生长因子或原患者血清（1%-2%）以利细胞生长。培养方法很多，主要有组织块法、酶消化法、钽网法、脱落细胞法等。 1.组织块法 将取得的瘤组织去除脂肪、结缔组织及坏死部分，在平皿中用Hanks液 洗3次，剪碎组织，切成1-2mm3小块，接种于事先涂有鼠尾胶原的培养 瓶（或皿）中，37℃、5%CO2或加盖并塞在普通恒温箱中培养。 2.酶消化法 在上述的碎组织块中加入0.25%胰蛋白酶或2000U/ml胶原酶，在37℃水 浴中消化30min或更长一些，去除消化液，用洗液洗3次，培养基洗1次后，用完全培养基悬浮，并用吸管吹打分散制成细胞悬液，计数。以 （5-10）x108个/L细胞浓度，在含有10%小牛血清的RPMI、EagleMEM或DMEM中，在37℃、5%CO2下分瓶（或皿）中培养。 3.钽网法 在一张面积约为1cm2的钽网上放入上述剪碎的一块或几块肿瘤组织块 （1-2mm3大小），用镊子轻压，使其粘于网上，再把但网放入培养皿中，使网下的组织块与皿壁紧紧接触，于37℃、5%CO2下培养，每隔2-
3天换液一次，5 天后可见有上皮细胞从网上移出，并能在相当于肿瘤组织部位形成纯净的单层上皮细胞。 4.脱落细胞法 将新鲜的肿瘤组织去除脂肪和结缔组织，洗液洗2次后，用刀片将肿瘤组织切成细薄片，在切割的同时有许多上皮细胞脱落下来，脱落细胞经洗涤后，加入完全培养基，便可获得较纯的上层细胞，于培养瓶（或皿）中，37℃、5%CO2下培养，每隔2-3天换液一次，7-10天上皮细胞逐渐长成单层。
细胞培养技术在肿瘤治疗中的应用
细胞培养技术在肿瘤治疗中的应用肿瘤，是指细胞或组织在身体内异常增生并失控的状态。肿瘤的治疗方式有许多种，包括手术、放疗、化疗、靶向治疗等。而随着细胞培养技术的进步，肿瘤治疗的方式也在逐渐改变。本文将深入探讨细胞培养技术在肿瘤治疗中的应用。 一、细胞培养技术介绍 细胞培养技术是将细胞从原发组织或体液样本中分离出来，然后将其培养在合适的培养基中，利用培养基中的营养物质来促进细胞增殖和分化，使其不断扩增。细胞培养技术是生物医学研究和药物开发的重要手段，可以用于细胞生物学研究、药物筛选、细胞工程等领域。 二、肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞是指在体内或外部培养条件下失去了正常细胞生长调节的肿瘤细胞。肿瘤细胞的培养是肿瘤研究的重要手段，可以用于了解肿瘤的发生、发展机制以及治疗新方法的研究。
肿瘤细胞的培养方法与正常细胞的培养方法基本相同。将肿瘤细胞分离出来后，将其悬浮于培养基中，利用不同的培养基、血清和生长因子等营养物质来促进细胞增殖和分化。但是，肿瘤细胞由于失去了正常细胞的调节，故往往比正常细胞更易于分裂。 三、肿瘤细胞的应用 1、肿瘤细胞的实验研究 肿瘤细胞的培养在肿瘤研究中有着广泛的应用，可以用于了解肿瘤发生、发展机制以及治疗新方法的研究。通过对肿瘤细胞的培养，可以做到以下几点： （1）了解肿瘤细胞的特性：肿瘤是由恶性细胞组成的，因此肿瘤细胞在生长和生存上与正常细胞存在巨大的差异。通过对肿瘤细胞的培养，可以了解到肿瘤细胞的生长特点、分化特点和基因表达情况，从而开展更深入的研究。
（2）寻找抗肿瘤药物：肿瘤细胞培养可以用于筛选抗肿瘤药物。通过对不同药物的加入，可以测试不同药物对肿瘤细胞的影响，从而筛选出更有效的药物。 2、肿瘤细胞的移植研究 肿瘤细胞的移植研究是在动物体内将肿瘤细胞移植到其特定的器官或者组织中，并观察肿瘤细胞的生长、转移与侵袭的一类实验方法。它可以用于预测肿瘤的危险性和发生情况，测试和评价药物的疗效，探究肿瘤转移的过程和机制。 肿瘤细胞株的移植通常是通过注射或者种植的方式来实现的，通常会在小鼠、裸鼠、兔子等小动物中进行。 3、肿瘤免疫研究 肿瘤细胞的免疫研究是肿瘤免疫学研究的重要组成部分。在我们体内，大部分肿瘤细胞为免疫系统视作异己而被抑制扩散，但是肿瘤细胞可通过多种途径对人体的免疫系统发动进攻，最常见的方式是通过抑制细胞免疫和体液免疫的有效功能而逃避免疫系
肿瘤细胞培养
肿瘤细胞培养 肿瘤细胞培养是一种对肿瘤细胞进行体外增殖和研究的重要方法。它不仅有助于我们更好地理解肿瘤的发生机制，还为肿瘤的诊断和治疗提供了有力的工具。本文将介绍肿瘤细胞培养的基本原理、方法和应用。 一、肿瘤细胞培养的基本原理 肿瘤细胞培养的基本原理是利用体外培养条件模拟体内微环境，提供细胞生长所需的营养物质、培养基和合适的温度、pH值等因素，使肿瘤细胞在培养皿中快速增殖。培养的肿瘤细胞可以源自原发肿瘤组织、转移灶或肿瘤细胞系，通过适当的培养条件，能够在体外长期维持其生物学特性。 二、肿瘤细胞培养的方法 1. 细胞来源选择 肿瘤细胞培养的最初步骤是选择合适的细胞来源。可以从患者的原发肿瘤组织或转移灶中分离细胞，也可以使用已建立的肿瘤细胞系。选择适宜的细胞来源是确保实验结果准确性的关键。 2. 细胞分离和传代 细胞分离是将肿瘤组织或培养皿中的细胞分离出来，常用的方法有胰蛋白酶消化、机械切割等。分离的细胞可以根据需要进行一定次数的传代，以延长细胞的寿命并获得足够的细胞数量。
3. 细胞培养条件 细胞培养条件是保证肿瘤细胞在体外生长和繁殖的关键。首先是选 择适宜的培养基，其中包含维持细胞生长所需的营养物质、生长因子 和抗生素等。此外，还需要控制培养温度、CO2浓度和pH值等条件，模拟体内环境。 4. 细胞检测和鉴定 培养的肿瘤细胞需要进行鉴定，以确保其纯度和稳定性。常用的方 法有细胞形态观察、免疫组织化学染色、流式细胞术等。鉴定后的细 胞可以用于进一步的实验研究。 三、肿瘤细胞培养的应用 1. 药物筛选和耐药性研究 肿瘤细胞培养可以用于药物筛选，通过观察不同药物对细胞的影响，筛选出对某种类型的肿瘤细胞有特异性杀伤作用的药物。此外，肿瘤 细胞培养还可以用于研究耐药性的机制和逆转耐药的方法。 2. 基因功能研究 通过转染技术将特定基因靶向敲除或过表达到肿瘤细胞中，可以研 究基因在肿瘤发生发展中的功能，并探索潜在的靶向治疗策略。肿瘤 细胞培养为基因功能研究提供了良好的实验材料。 3. 肿瘤发生机制研究
肿瘤细胞的培养及其实验的方法
肿瘤细胞的培养及其实验的方法 肿瘤细胞的培养及其实验的方法 肿瘤细胞在组织培养中占有核心的位置，首先癌细胞是比较容易培养的细胞。当前建立的细胞系中癌细胞系是最多的。另外肿瘤对人类是威胁最大的疾病。肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药检测、癌分子生物学极其重要的手段。肿瘤细胞培养对阐明和解决癌症将起着不可估量的作用。 一、组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点： （－）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 （二）生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。 （三）永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种
细胞建株(系) 培养
细胞建株(系) 培养 一、概念 1、细胞系（Cell Line）：原代培养舞经首次传代成功即成细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系（Lineage of Cells）所组成。 2、细胞株（Cell Strain）：通过选择法或克隆形成法从原代培养物或细胞系中获得具有特殊性质或标志物称为细胞株。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。如果不能继续传代或传代数有限，称为有限细胞株（finitecell strain）；如果可以连续传代，称为连续细胞株（continuous cell strain）。对于人类肿瘤细胞，在体外培养半年以上，生长稳定，并连续传代的即可称为连续性株或系。 二、建立细胞系（或株）的要求 什么样的体外培养群可被认可为己鉴定的细胞，视具体情况而定，无统一规定。对于用作原代培养的细胞只要供体均一，取材部位及组织种类等条件稳定即可，如用做长期培养，特别是反复传代的细胞，常需做如下说明： 1、组织来源：细胞供体所属物种，来自人体或者动物； 个体性别、年龄；取材的器官或组织。 如系肿瘤组织，应说明临床和病理诊断，以及病历号等。 2、细胞生物学检测： 了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞一般形态，特异结构，细胞生长曲线和分裂指数，倍增时间，接种率等。 如为肿瘤细胞，为说明来源于原肿瘤组织并保持恶性，须做软琼脂培养，异体接种致瘤和对正常组织侵润力等实验。 3、培养条件和方法；应说明细胞系（或株）适应的生存环境，即指明使用的培养基、血清种类、用量以及适宜PH值。 三、若干细胞建株的要点及基本过程 （一）肿瘤细胞培养技术要点 1、取材：材料主要来源于外科手术或活检瘤组织，取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养材料。取材后尽快培养，因故不能立即培养者，可冻存。其培养方法及冻存方法同前述正常组
肿瘤细胞的培养
第6章肿瘤细胞的培养 肿瘤细胞培养是研究癌变机理、抗癌药的敏感性、肿瘤细胞和癌分子生物学特性的重要手段。癌细胞是比较容易培养的细胞，当前所建立的细胞系中癌细胞是最多的。应用体外细胞培养技术进行肿瘤研究具有许多优点： (1)可免受机体内环境因素的影响，避免了个体差异性，便于探索各种物理、化和生物 因素对肿瘤细胞生命活动的影响。 (2)既便于从细胞水平上研究肿瘤细胞的结构与功能，又便于从基因及分子水平上研究 癌变的发生机理； (3)可长期传代、保存，便于观察肿瘤细胞生物学特性和遗传行为的改变。 (4)可用于快速筛选抗癌药物和研究耐药机理。 (5)研究周期短，比较经济。 但是它也有缺点，如长期培养可使细胞生物学特性发生改变；体外实验所得的结果不能完全代表体内的情况，应与体内试验结合研究更为合理等。 一、肿瘤细胞培养的生物学特性 1、形态和性状 形态不规则，细胞界限清晰，伸展较差，核膜、核仁轮廓明显，核仁多、核浆丰富。折光性强，电镜观察细胞表面微绒毛多而细密，与肿瘤细胞具不定向运动和铺着不依赖性有关。 2、生物特性 癌细胞在无血清或低血清(2%～5%)时仍能生长，营养要求不高，因能自分泌促增殖因子，在软琼脂培养时单个细胞能形成集落，生长方向性消失，再加上失去了接触抑制，癌细胞数量增多时可呈多层重叠生长，细胞饱和密度大，有丰富的三极有丝分裂，分裂指数高，细胞倍增周期短。 3、永生性 永生性也称不死性，在体外培养中表现为可无限制传代而不凋亡(Apoptosis)，体外培养的肿瘤细胞系(株)都表现有这种特性。但体外培养的永生性和体内肿瘤的恶性(包括侵润性)是两种性状，受不同基因调控的，因恶性肿瘤多数在体外培养时并不那么容易获得成功，生长增殖能力并不旺盛，有时只能传若干代，说明体外培养的永生性可在体外培养后获得的。另外，体外培养的许多细胞系，如NIH3T3、Rat-1 10T1/2等均具有永生性而无恶性。但两者有相关性，永生性可能是细胞恶性变的某一阶段。 4、侵润性 侵润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，体外培养的肿瘤细胞仍保持有这种特性，当与正常组织混合培养时，能侵润入其他正常组织中，甚至能穿透人工隔膜。 5、异质性 所有肿瘤细胞都是由增殖能力、遗传性、起源、周期状态等性状不同的细胞组成，属于异质性，其中有的衰老、退化，有的处于周期阻滞状态，只有那些处于活跃增殖的肿瘤干细胞才是支持肿瘤生长的成分，肿瘤干细胞易于生长增殖，分离培养干细胞的方法称干细胞培养(有干细胞系和数个亚系组成)。
原代肿瘤细胞的分离培养
原代肿瘤细胞的分离培养 实验目的：从新鲜人体标本中分离肿瘤细胞 实验器材：新鲜人体乳腺癌组织 胶原酶（Ⅰ、Ⅳ型胶原酶干粉溶解于DF12培养基，浓度1mg/ml），DMEM培养基，胎牛血清，PBS，双抗（青链霉素，100×） 手术器械，培养皿，培养瓶，离心管，恒温摇床，离心机，倒置显微镜，细胞培养箱 实验原理： 酶消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶。胰蛋白酶是一种胰脏制品，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分散开，适于消化细胞间质较少的软组织，能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等，它对细胞间质有较好的消化作用，对细胞本身影响不大，可使细胞与胶原成分脱离而不受伤害。 本实验就使用Ⅰ、Ⅳ型胶原酶对乳腺癌组织进行消化，以获取原代乳腺癌细胞。实验步骤： 1.将新鲜乳腺癌组织置于培养皿中，加入适量ＰＢＳ，使用眼科镊和眼科剪去除组织上的 血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织，保留肿瘤细胞丰富的区域，并用ＰＢＳ清洗两遍。 2.将癌组织放入新的培养皿中，加入少量DMEM培养基，使用眼科剪将组织剪成约1mm3 大小的碎块。 3.转入15ml离心管中，用PBS冲洗数遍，组织块自动下沉后，除去PBS。 4.将组织块转入培养瓶中，加入5ml胶原酶和双抗（稀释至2×），吹散组织碎块，置于 ３７℃恒温摇床上消化组织，调节速度150r/min，每隔30min于镜下观察一次。 5.待组织块镜下透光性良好，呈絮状时，转入15ml离心管中，1300r/min离心5min，弃 上清。 6.加入PBS洗涤数次，反复吹打后，1300r/min离心5min，弃上清。 7.加入DMEM完全培养基（含1×双抗），反复吹打，转入培养皿中，镜下可见单个细胞 及细胞团，细胞培养箱培养。 注意事项： 1.全程严格无菌操作。 2.取材要注意新鲜和保鲜。 3.取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，尽可能减少对细胞的机械损伤，切碎组织时 应避免组织干燥。
肿瘤干细胞的分离及其治疗应用
肿瘤干细胞的分离及其治疗应用 肿瘤是机体内细胞异常增生所形成的疾病，长期以来是全球人类健康领域的一大难题。虽然传统的化疗与放疗等治疗手段已经获得了显著的疗效，但是随着癌症种类的不断增多，传统治疗的局限性和毒副作用逐渐凸显。近年来，人们开始重视肿瘤干细胞（CSCs）在肿瘤发生、发展、转移、复发等方面的关键作用。本文将就肿瘤干细胞的分离及其治疗应用做简要介绍。 一、肿瘤干细胞的定义 肿瘤干细胞是指具有自我更新和分化能力的肿瘤细胞亚群，是维持肿瘤生长和发展的关键细胞种群。CSCs可自我更新、不断分裂产生更多的CSCs或分化成较为成熟的肿瘤细胞。CSCs不但具有肿瘤起源的来源、维持和发展作用，而且能够潜伏在机体内造成肿瘤的复发和转移。 二、肿瘤干细胞的分离方法 1、螺旋挤压法 利用此方法可从肿瘤组织中获得单一肿瘤细胞，主要利用了体外3D组织培养模型（spheroid）作为皿底贴壁或者SFM的培养基。该方法简便快速，能获得大量分离的CSCs。 2、染色质免疫沉淀法 此法是针对特定的转录因子，利用其DNA结合特性设计寡核苷酸上凝集体或者DNA序列对特定转录因子进行免疫沉淀。该方法适用于大量筛选，还可以精确定位目标CSCs。 3、表面标记技术
可以通过细胞表面某些标记物的特异性抗体，将其分离出来做进一步机理研究，共同发掘肿瘤干细胞的特性。 三、肿瘤干细胞的治疗应用 1、免疫治疗 CSC是肿瘤细胞亚群中最具有免疫逃逸能力的细胞。研究人员利用激活免疫细胞、转移转录因子和肿瘤相关抗原等方式，使免疫细胞杀伤CSCs。而针对CSCs 的免疫细胞在临床上同时具有治疗肿瘤的效果。 2、基因治疗 针对CSCs的基因工程具有广阔的前景。在CSCs放射抗性和化疗敏感性差的 背景下，基因治疗有望通过表观遗传学、启动子甲基化、组蛋白去乙酰化等方式使CSCs的抗疗性得到扫除。例如，近年来多项研究表明，针对CD47基因的抗体阳 性踏迹分子具有在人类癌症中靶向CSCs的效果。 3、微环境治疗 CSCs通常依托于微环境来提供维持其干性细胞特性的必需信息，包括生长因子、细胞外基质、细胞与细胞之间的相互作用等。一些研究者通过分子信号屏蔽剂、破坏胞外基质结构、抑制CD44等方式影响CSCs的生存环境，检验发现可以有效 抑制CSCs的增殖和活性。 四、总结 CSC作为肿瘤细胞亚群中的重要成分，在肿瘤的发展、转移、复发和治疗方面 起着举足轻重的作用。尽管随着人们对肿瘤干细胞越来越熟悉和理解，但CSCs的 特性、分子机制、治疗策略仍然是科学家们需要不断研究挖掘的课题。相信在不久的未来，基于CSCs的治疗新策略会为抗癌事业的顺利推进注入新的动力。