耐热保护剂

③能升高成品的塌陷温度，阻止因塌陷而引起的蛋
白质药物的破坏


不同氨基酸对微生物的保护
甘氨酸、谷氨酸钠－病毒、细菌、HVT L－精氨酸－POX、HVT、PPV L-半胱氨酸－ND、IBD、IBV L-组氨酸－MD、IBD、IBV
其它添加剂类 （1）抗氧化剂 （2）缓冲剂 抗氧化剂

表面活性剂可分为离子型和非离子型。凡是溶于 水时能电离成离子的，称为离子型表面活性剂， 否则，称为非离子型表面活性剂。 在冻干生物制品测定长期储藏中，表面活性剂并 没有保护作用。


氨基酸类保护剂
氨基酸是蛋白质的基本构成单位，其中最主要
的是α -氨基酸。它是由一个氨基（-NH2）、一 个羧基（-COOH）、一个氢原子（-H）和一个R 基团（-R）连接在一个α 碳原子所组成 常用的氨基酸类的保护剂：甘氨酸、谷氨酸、
对耐热保护剂中各物质分子吸附过多，致使保护剂
各成分的最终含量低于保护剂配方的要求含量。影
响耐热保护剂活疫苗的产品质量
解决方法： 要求吸附性小的滤芯，最好是进口的。进口滤芯
（Millipore）即可以增加使用次数，除菌效果
又好。国产滤芯吸附性大，而且使用次数少，又
不稳定，影响保护剂的质量
3. 耐热保护剂保存与使用
– 能在冻干和保存时维持疫苗的稳定性
– 在初次干燥时适宜的温度下疫苗不倒塌
– 低成本易获取 – 易灭菌 – 可溶性 – 外形美观
2. 按相对分子量分类

低分子化合物—提高微生物存活率形成均一悬液。
①酸性物质：谷氨酸、天冬氨酸、乳酸
②中性物质：乳糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇 ③碱性物质：精氨酸、组氨酸

高分子化合物—对微生物保护作用，促进升华形 成耐热骨架阻断热传导和热辐射。如：白蛋白、 明胶、蛋白胨、脱脂奶粉
明胶


Sigma公司：175、225、325
水解明胶：德国、美国 国产明胶（北京、上海）
脱脂奶粉

Difco脱脂奶粉
国产脱脂奶粉
制备酸奶用，无抗生物素 食品用脱脂奶粉 工业用，沉淀剂、絮凝剂
物制品起到很强的支撑作用
④ 在含有缓冲剂的乳酸脱氢酶配方中，10％的PVP
因能抑制磷酸氢二钠的结晶，从而抑制了系统的
pH降低

表面活性剂类
降低界面的张力，亲水、亲油基组成的化合物。

表面活性剂在冻结和脱水过程中降低冰-水界面
张力所引起的冻结和脱水变形，又能在复水过程
中对活性组分起到润湿剂和重褶皱剂的作用。
疫苗块的倒塌温度由赋形剂组成的相对浓度决定
保护剂应在抗原收获或冻干前加入抗原中
它应含有中和羧基活性的物质
电解质成分应含量最少

影响保护剂的因素 种类、浓度、配制方法



灭菌方法
pH值 制品表面积
四. 耐热保护剂在配制过程中注意事项
1. 保护剂在配制过程中注意事项


水的标准
称量的准确度和误差
3 二次干燥（解吸附作用）
1.预冻ຫໍສະໝຸດ Baidu

预冻速度：控制在每分钟下降1℃左右 产品降至－40℃或冻干机所能降的温度，确保 箱内所有疫苗瓶内都降到共熔点以下
解决方法： 按耐热保护剂灭菌的要求时间、温度进行操作 （121℃15分钟）,建议使用适当的容器，装量不 宜过大（达到上温快、降温快）。高压后，仪表 降至零，应立即打开高压锅门，不要把保护剂闷 在锅里等冷却后取出，更不要在高压锅里过夜

小分子部分（过滤部分）
不匹配的滤芯也会影响保护剂的质量。不合理滤芯
猪瘟耐热冻干保护剂活疫苗
王
栋
研究员
中国兽医药品监察所
一.耐热冻干保护剂基质的分类 二. 耐热冻干保护剂作用机理 三. 耐热保护剂在配制过程中注意事项
四. 耐热保护剂冻干工艺的优化
五.耐热冻干保护剂活疫苗在冻干过程中常见 异常现象的处理
—. 耐热冻干保护剂基质的分类
1. 耐热保护剂特性
– 有免疫活性但无药理活性
（1）玻璃态假说
保护剂不发生结晶时，保护剂与活性组分混合物就会 形成

玻璃态分为强玻璃、弱玻璃
在玻璃化转变温度以下进行降温，弱玻璃黏度的增加
比强玻璃来的快。因此，赋形剂形成弱玻璃要比形成
强玻璃的保护效果要好得多。蔗糖和海藻糖就是因为
能够形成一种弱玻璃而具有很好的保护作用
（2）水替代假说
在蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过氢键
① 由于蛋白质溶液在冻结过程中，溶液的浓度逐渐
升高。在高浓度时可改变溶液的PH，pH值变化4个单
位导致蛋白质变性，使生物制品失活。
②在冻干保护剂配方中，需添加适量缓冲剂。如：
磷酸二氢钾、磷酸氢二钠

冻干加速剂
冷冻干燥过程耗时长、耗能多，迫切需要对冻干 循环进行优化，降低生产成本。如：叔丁醇 叔丁醇是一种小分子醇，与水完全互溶，具有低 毒性、高蒸气压。
③ 按照保护剂配方中的先后顺序依次加入溶解。
④ 大分子物质与小分子物质混合时，边摇边加，
使二者充分混匀，混合后观察有无沉淀，如有
沉淀应停止使用。
⑤ 耐热保护剂均应按保护剂质量标准要求进行保
存，不合理的保存也会影响保护剂的耐热性能。
2. 耐热保护剂的灭菌


大分子部分（高压部分）
高压温度高，时间过长
叔丁醇在药品水溶液中能起到以下作用： ①可以降低干燥层阻力，从而加速干燥过程，缩短 干燥时间 ②溶解难溶于水的药品
③使产品具有高的比表面积、好外观，并易于复水
④可提高药品溶液和冻干品的稳定性
⑤有一定的抑菌作用
=. 耐热冻干保护剂作用机理
1
2 3
冻结过程中低温保护的机理
干燥过程中的保护机理 储藏过程中的保护机理
分子空间结构和生物活性所必须的水分子，从而
减轻了生物大分子冻干损伤

保护剂对细菌细胞膜的保护
水分子可通过氢键与细胞膜中磷脂的极性端相连，
而且每个磷脂的极性端与其他磷脂分子的极性端
被水分子隔开。冻干保护剂特别是糖类保护剂分
子上的羟基具有与膜磷脂上的磷酸集团连接形成
氢键的能力，从而阻止和限制细胞膜因脱水而融
溶解顺序
大分子物质与小分子物质混合
保护剂贮存温度
① 配制过程中水的要求
配制用水为注射用水或去离子水，水的电导率＜
1μ s/cm（相当于100万Ω ）。
② 保护剂的称量
在配制过程中，用量筒准确量取所需注射用水量，
准确称取各保护剂成分逐次加入，一种成分完全
溶解后再加入另一种成分，直至完全加完。（操作
必须由2个人来完成，1人称量、1人复核）。
3
储藏过程中的保护机理
干燥过程中出现的引起蛋白质变质的时间尺度为小
时，而对于储藏而言，时间尺度为月或年。在正确
冷冻干燥工艺中，要求产品温度接近于其玻璃化转
变温度，而在正确的储藏条件下，环境温度应当比
其玻璃化转变温度低得多，以获得很长的松弛时间

保护剂指导原则
蛋白质、二糖、氨基酸和缓冲盐水
② 具有一定的表面活性
③ 在蛋白质分子之间产生位阻
④ 提高溶液黏度
⑤ 显著提高玻璃化转变温度 ⑥ 抑制小分子赋形剂（如蔗糖）的结晶
⑦ 抑制溶液pH值变化

聚乙烯毗咯烷酮（PVP K30）
① 常被用作澄清剂、色素稳定剂和胶体稳定剂
② PVP对生物材料的低温保存和冷冻干燥，都是很
好的保护剂
③ 它在脱水干燥过程中又是很好的填充剂，对生

按耐热保护剂质量标准要求保存。大分子部
分与小分子部分按比例混合后置2～8℃保存，一
般不要超过10日

每一种保护剂在使用过程中禁止单一加入
(如：将小分子加入抗原后，再加入大分子物质)，
应将小分子物质与大分子物质按比例混合均匀后
与抗原混合，进行分装
五. 冻干工艺的优化

冻干过程
1 预冻
2 一次干燥（冰升华）

山梨醇
① 山梨醇是甘露醇的同分异构体，但其溶解度比
甘露醇大，在常温下黏稠状透明液体，有旋光性；
略有甜味，具有吸湿性，高温下不稳定。在冷冻
干燥配方中，山梨醇用作填充剂
② 与PVPk30合用减少产品裂纹，易碎性

聚合物类
如：聚乙烯毗咯烷酮、葡聚糖、牛血清白蛋白

聚合物类具有以下的性质：
① 聚合物在冻结过程中优先析出
“优先作用”机理并不能完全解释用聚合物或蛋
白质自身在高浓度时保护蛋白质的现象。因此，
必然存在其他保护作用机理。表面张力减小的机
理可以用于解释表面活性剂对蛋白质溶液冻结过
程的保护。限制蛋白质分子扩散的机理认为，许
多保护剂都能够提高溶液的黏度，抑制活性分子
的扩散
2
干燥过程中的保护机理 在含有保护剂溶液的干燥过程中，当浓度足够大且
高压瓶子的大小也会影响保护剂的性能，同是一批
保护剂，使用1000ml装量瓶与8000ml装量瓶高压后
保护剂的性能有明显差异，装液体多的瓶子上温时
间较慢，这样在达到某一温度就需要很长时间，导
致保护剂中各成分分解变性

高压后闷锅现象
保护剂在高压后不及时打开高压锅门，致使保
护剂在同一温度停留的时间比较长，影响保护 剂中各成分性能，导致保护剂在冻干过程中起 不到保护作用

糖/多元醇类 聚合物类 表面活性剂类

其它添加剂类
糖/多元醇类 ① 单糖：葡萄糖、半乳糖

② 低聚糖：蔗糖、海藻糖 ③ 多元醇：甘露醇 、山梨醇 、丙三醇 功能和作用:

糖与生物制品活性组分的分子形成氢键而代替了 原有水的位置起保护作用

低聚糖：低温保护功能和脱水保护作用 多元醇和糖一样，官能团也是羟基

精氨酸、组氨酸

甘氨酸是最好的填充剂

氨基酸
① 甘氨酸、谷氨酸或谷氨酸钠
② L-半胱氨酸 ③ L-组氨酸 ④ L-精氨酸 ⑤ 复合氨基酸（199、MEM）

甘氨酸
①低浓度甘氨酸可通过抑制10或100mol/L磷酸缓冲
盐结晶，所致pH值的改变而阻止蛋白质药物变性
②可阻止冻干过程中重组人生长激素的聚集
合，降低相变温度，使脂膜不易向凝胶相转变而
保持液晶相，增加膜的流动性

保护剂对蛋白质的保护
由于蛋白质分子中存在大量的氢键，结合水通过
氢键与蛋白质分子联结。当蛋白质在冷冻干燥过
程中失去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质
表面上水的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合
层”，这样就可以保护氢键的连结位置不直接暴 露在周围环境中，从而保持了蛋白质天然结构和 功能的完整性
与蛋白质分子联接。当蛋白质在冷冻干燥过程中失
去水分后，保护剂的羟基能够替代蛋白质表面上水
的羟基，使蛋白质表面形成一层“水合层”，这样
就可以保护氢键的联结位置不直接暴露在周围环境
中，从而保持了蛋白质天然结构和功能的完整性
“水替代”假说，当冷冻干燥时，保护剂可与生
物大分子的失水部位形成氢键，替代保持生物大
1
冻结过程中低温保护的机理
“优先作用”机理认为，蛋白质溶液在达到最大冻
结浓度之前，优先与水作用（优先水合），而保护
剂优先被排斥在蛋白质区域外（优先排斥）。这是
由于保护剂的加入，增大了水分子的表面张力，促
使了蛋白质分子优先与水分子相互作用。在这种情 况下，蛋白质分子外表面比其体相中有相对较多的 水分子和相对较少的保护剂分子，从而也就保护了 蛋白质的天然构象
胶等
（3）抗氧化剂

自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧
阻断冻干样品中氧化链式反应
抑制氧化酶的活性，防止样品在冷冻干燥及储藏过
程中氧化变质。如硫代硫酸钠 、维生素E、维生素C
（4）酸碱调整剂 将生物制品pH调整到活性物质的最稳定范围进行冷 冻、干燥。如：磷酸二氢钾、磷酸氢二钠
4. 按物质的种类分类

海藻糖
①具有相对较高的玻璃化转变温度。海藻糖—蛋
白质—水微冰晶的形成而提高，有效防止了水
对玻璃化态的增塑作用
②较弱的吸湿性
③内部氢键少，有利于蛋白质分子之间形成氢键
④化学活性非常低

甘露醇
①白色 结晶粉末，无臭、味甜，水中易溶
②无菌滤液稳定，不易被氧化
③提供支持结构
④不与活性组分发生反应
⑤1.4%PVP冻干样品脆断力为142g，有收缩迹象，与 甘露醇联合使用，抗断裂的强度可提高3～25倍， 保证冻干物料的颜色和质地均匀，没有收缩

（3）冻干加速剂
①自身氧化，消耗冻干样品内部和环境中的氧，使
冻干样品物料不被氧化
② 给出电子或氢原子，阻断冻干样品中的氧化链
式反应
③ 通过抑制氧化酶的活性而防止冻干样品的氧化
。如：维生素E、维生素C、硫代硫酸钠、硫脲.

缓冲剂
蛋白质具有两性电解质性质，既能和酸又能和碱作 用。在中性环境中，大多数蛋白质是稳定的

脱脂奶粉、明胶（175、225、325）在冻干过程中 的作用 促进升华

易取得均质产品
加热灭菌

扩大细胞相互间的距离
3. 按保护剂功能和性质分类
（1）耐热冻干保护剂
疫苗在冻结和干燥过程中，防止活性组分发生变
性。如：海藻糖、蔗糖、聚乙烯吡咯酮（PVP）
等
（2）填充剂
防止组分随水蒸气一起升华逸散。如：甘露醇、明