外植体的选择与培养

第三节 外植体的选择与培养
接种时的无菌操作技术：



(1)对接种材料进行消毒； (2)先解开包口纸，将试管等拿成斜角，使试管口在酒 精火焰上方转动，灼烧数秒钟； (3)用灼烧过的镊子夹取外植体送入试管内，轻轻插入 或放在培养基表面； (4)接种完后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟； (5)接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、 走动和咳嗽等； (6)接种工具随时蘸95%酒精灼烧，避免交叉污染； (7)接种完毕后要清理干净并用70%酒精擦工作台。
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
本章小结：
(1) 常用的培养基：①MS培养基；②B5培养基；③ White培养基；④N6培养基；⑤KM-8P培养基。 (2) 水、无机盐、有机物质、天然复合物、凝固剂是构成 培养基的五种主要成分。 (3) 配制母液。即先配成大量元素10倍液；微量元素100 倍液；铁盐100倍液；有机物100倍液。 (4) 培养基配置、分装、高压灭菌 (5) 筛选培养基方法，即单因子试验法、多因子试验法、 广谱实验法。
愈伤组织
A
外植体
C
B
试 管 苗
第三节 外植体的选择与培养
胚状体的产生途径：
(1)、直接从器官上发生 (2)、从愈伤组织发生 (3)、从游离的单细胞发生 (4)、从小孢子发生
Байду номын сангаас
诱导胚状体比诱导芽的优点：
(1)数量多 (2)速度快 (3)结构完整
第三节 外植体的选择与培养
五、培养过程中常出现的问题 及解决方法
第四节、试管苗驯化与移栽
四、提高试管苗移栽成活率的途径
1、试管苗的生理状况：移栽壮苗 2、植物生长调节物质：适当加入生长素，去 除细胞分裂素，有利生根，提高成活率 3、无机盐浓度：适当降低 4、加入少许活性炭 5、控制好移栽前10天的光、温、湿环境因子 6、使试管苗从无菌向有菌逐渐过渡
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
四、外植体成苗途径
1、外植体→愈伤组织→根、芽→试管苗 ①同时长芽和根 ②先长芽，再长根 ③先长根，再长芽 2、外植体→胚状体→试管苗（胚状体途径） 3、外植体→根、芽→试管苗（器官发生途径）
第三节 外植体的选择与培养
外植体成苗途径：
根、芽 芽 胚状体 芽、根 根 根 芽
较好
第三节 外植体的选择与培养
三、外植体的接种与培养
（一）接种—无菌操作 定义:把经表面灭菌处理后植物材料，切碎或分 离出器官、组织、细胞，再经无菌操作转接到 无菌培养基上，这一过程叫做接种。
第三节 外植体的选择与培养
接种前的准备工作：
(1)在接种前1-2周用甲醛熏蒸接种室； (2)接种前15-20min，打开超净工作台的风机以及台上的 紫外灯； (3)接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，及拖 鞋等； (4)上工作台后，用酒精棉球擦拭双手。然后70%酒精喷 雾降尘，并擦拭工作台面； (5)先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子蘸95% 酒精在酒精灯火焰上灼烧，放置冷却。
第三节 外植体的选择与培养
（二）、外植体的褐变
1、定义： 是指外植体在培养中体内的多酚氧 化酶被激活，使细胞里的酚类物质氧化 成棕褐色的醌类物质，有时使整个培养 基变褐，从而抑制其他酶的活性，影响 材料的培养。
第三节 外植体的选择与培养
2、褐变的主要原因
①植物品种 ②生理状态 ③培养基成分 ④培养条件不当
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
本章小结：
(6) 植物培养技术：灭菌、接种、培养和驯化四个环节。 (7) 灭菌与消毒的方法。 (8) 接种程序：①植物材料表面的消毒；②切割外植体； ③将外植体移人培养基。 (9)培养方法：固体培养法和液体培养法。 (10)接种材料的培养：①初代培养；②继代培养；③生根 培养 (11)试管苗驯化：注意基质、温、光、水、肥、气的综合 管理。
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第三节 外植体的选择与培养
一、外植体的选择： 种质优良
选材
植株健壮
取材的最适时期
适宜的大小
第三节 外植体的选择与培养
二、外植体灭菌
1：对材料进行预处理 2：材料表面灭菌： 1）水洗,滤纸吸干; 2)70%酒精浸30～60s; 3）用灭菌剂处理; 4）用无菌水冲洗.
小麦试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
二、炼苗（驯化）


驯化的目的： 通过减肥、增光、降温、控水等措施，提高 试管苗对外界环境条件的适应性，提高光合 作用的能力，提高试管苗的移栽成活率。
第四节、试管苗驯化与移栽
三、试管苗的移栽
（一）移栽方法：

1、直接移栽法 2、常规移栽法 3、嫁接移栽法
第三节 外植体的选择与培养
（二） 外植体培养
外植体培养：指把培养材料放在培养室里，使之 生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化 成再生植株的过程。
第三节 外植体的选择与培养
培养的环境条件:
光照 培养室 培养条件 氧气
温度
湿度
第三节 外植体的选择与培养
定义：培养物在培养基上生长一段时间以后，由 于营养物质枯竭，水分散失，以及代谢产物 的积累，必须转移到新鲜培养基上培养,这个 过程叫做继代培养。
第1章 植物组织培养实验室 构建及操作技术
第四节、试管苗驯化与移栽
草莓
试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
一、试管苗的特点
1、试管苗的生态环境： 高温且恒温、 高湿、 弱光、 无菌
百合试管苗
第四节、试管苗驯化与移栽
2、特点：(与常规苗相比）
(1)生长细弱； (2)光合作用差 (3)叶片气孔数目少，活性差 (4)根的吸收功能弱 (5)对逆境的适应和抵抗能力差
2、玻璃化现象产生的原因
细胞分裂素浓度较高时； 琼脂浓度低时； 温度低、光照时间长时； 气体交换不良时； 培养基中无机离子种类及比例不当时。
第三节 外植体的选择与培养
3、预防措施：
①适当控制培养基中无机营养成分； ②适当提高培养基中蔗糖和琼脂浓度； ③适当降低细胞分裂素和赤霉素浓度，增加生 长素量； ④增加自然光照，控制光照时间； ⑤降低培养温度，进行变温培养； ⑥增加容器通风，最好进行CO2施肥。
第三节 外植体的选择与培养
3、减轻褐变现象发生的措施
①选择合适的外植体： ②合适的培养条件： ③连续转移 ④加抗氧化剂： ⑤加活性炭
第三节 外植体的选择与培养
（三）玻璃化现象

1、定义：在长期的离体培养繁殖时，有些 试管苗的嫩茎、叶片呈现半透明水渍状， 这种现象称为玻璃化。
第三节 外植体的选择与培养
污染
褐变
组织培养三大难题
玻璃化现象
第三节 外植体的选择与培养
（一）污染
1、污染原因 细菌污染 真菌污染
真菌污染
第三节 外植体的选择与培养
2、污染的预防措施
(1)减少或防止材料带菌 (2)外植体灭菌要彻底 (3)玻璃器皿和金属器皿的灭菌 (4)布质制品的灭菌 (5)无菌室的消毒 (6)操作人员一定要严格按照无菌操作的程序进 行接种。
第三节 外植体的选择与培养
表面灭菌剂的种类较多，可选取1—2种使用。
常用灭菌剂使用浓度及效果比较表
使用浓度(%) 灭菌剂 次氯酸钙 9~10 持续时间 （min） 5~30 去除的难易 易 效果 很好
次氯酸钠 氯化汞
抗菌素
2 0.1~1
4~50mg/L
5~30 2~10
30~60
易 较难
中
很好 最好