毕氏酵母氯化锂转化法

毕氏酵母氯化锂转化法

试剂

1M LiCl <用去离子蒸馏水配制，0.22um滤膜过滤除菌；必要时用消毒去离子水稀释>

50% PEG3350 (氯化锂转化法只能PEG3350,不能用PEG8000,PEG3350

在北京莱博生物有售,80元/100克)

2mg/ml salmon sperm DNA / TE（10mM Tris-Cl, pH8.0, 1.0mM EDTA）-20℃保存

注：醋酸锂对毕氏酵母无效,对酿酒酵母有效，仅氯化锂有效；PEG3350可屏蔽高浓度LiCl的毒害作用。

感受态毕氏酵母的制备

1. 接种Pachia pastoris到50ml YPD培养基中，30℃摇菌过夜（约24～28h）培养到OD值为0.8～1.0（约108 Cells/ml）；培养基里有流沙样的菌体在流动

2. 收获细胞，用25ml无菌水洗涤一次，室温下1500g离心10min；

3. 重悬细胞于1ml 100mM LiCl溶液中，将悬液转入1.5ml离心管；

4. 离心机最大速度离心15秒沉淀菌体，重悬菌体于400ul 100mM LiCl溶液中；

5. 按50ul/管分装，立即进行转化；

注：不要将感受态酵母菌冰浴；

毕氏酵母的转化

1. 煮沸1ml鲑鱼精DNA 5min，迅速冰浴以制备单链担体DNA；鲑鱼精DNA主要是防止目的基因的降解，协助目的基因的转化

2. 将感受态酵母菌离心，以Tips去除残余的LiCl溶液；

3. 对于每一个转化，按以下顺序加入：

50% PEG3350 240ul

1M LiCl 36ul

2mg/ml 单链Salmon sperm DNA 25ul

5～10ug/50ul H2O 质粒DNA 50ul

4. 剧烈旋涡混匀直至沉淀菌体完全分布均匀（约1min）；

5. 30℃水浴孵育30min；

6. 42℃水浴热休克20～25min;

7. 6000～8000rpm离心收集酵母菌体；

8. 重悬酵母于1ml YPD培养基，30℃摇床孵育；

9. 1～4h后，取25～100ul菌液铺选择性培养基平板，于30℃培养2～3天鉴定；

毕氏酵母PEG1000转化法

试剂

缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylen e glycol

缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35

缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35

未污染的新鲜、试剂级DMSO，-70℃保存

注：1. 缓冲液A、B、C均用滤膜过滤，-20℃保存;

2. 将DNA直接加在冻结的酵母细胞上是本实验的关键之处（即使在冰上解冻的待转化细胞，其摄取外源DNA的能力也在解冻过程中迅速下降；如进行多样品的转化，建议按6样品/组进行）;

待转化毕氏酵母的制备

1. 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d;

2. 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜；

3. 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8；

4. 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次；

5. 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻，

6. -70℃保存

毕氏酵母的转化

1. 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率；

2. 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次；

3. 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀；

4. 30℃水浴孵育1h；

5. 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中；

6. 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中；

7. 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定；

毕赤酵母转化方法最常用的是电转化法和原生质体法,其中电转化法最为方便,

转化效率最高,最容易产生多拷贝整合。由于原生质体法必须首先制备去除细胞壁的原生质体细胞以利于DNA 进入,然后细胞再生细胞壁,产生转化体,而Zeoci nR 抑制细胞壁的形成,导致不能产生转化体。因此利用ZeocinR 作为选择标记的载体如p PICZ 系列,不能使用原生质体法进行转化。