葡萄酒中8种生物胺的测定

腐胺 - 16.347
0.22
内标1，7-二氨基庚烷 - 23.698
AU
组胺 - 22.659
酪胺 - 26.658
18.00
0.04 0.02 0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00
尸胺 - 18.000
0.06
20.00
Baidu Nhomakorabea
22.00 24.00 分钟
液相色谱参考条件
色谱柱为C18柱，
(150 mm×4.6mmID， 5µm)，紫外检测波长254nm，进样量10µL， 柱温30℃，流速：1.5mL/min。 梯度洗脱程序
时间 流动相 A 流动相B 0 55 45 7 65 35 14 70 30 20 70 30 27 90 10 30 100 0 35 100 0 36 55 45 45 55 45
X
标准谱图
0.80 0.70
酪胺 - 26.646 亚精胺 - 27.449
0.60
0.20
0.10
0.00 0.00 2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 分钟 26.00 28.00 30.00 32.00 34.00 36.00 38.00 40.00 42.00 44.00
生物胺的作用
微量的生物胺是生物体内正常的活性成分，
在生物活性细胞中具有重要功能，其中多胺 对细胞的生长和增殖具有重要作用。 生物胺作为药用( 鹿茸中的药用成分) 有重要 的生理功能, 如: 促进生长、增强代谢活力、 加强肠道免疫系统、控制血压, 并在神经系统 中有活性, 在消除自由基方面也有一定的作用 等。
葡萄酒中8种生物胺的测定
采用高效液相色谱法，柱前衍生，以1,7-二 氨基庚烷为内标，测定葡萄酒中色胺、苯乙 胺、腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺和亚精 胺含量。
生物胺简介
生物胺是一系列含氮低分子有机碱,
可分为单 胺和多胺两类, 包括酪胺、组胺、腐胺、尸胺、 苯乙胺、色胺、精胺和亚精胺等多种物质。 生物胺除了存在于各种动植物的组织中，还 普遍存在于多种食品中，尤其是发酵食品如 奶酪、发酵香肠、啤酒、黄酒、葡萄酒中等。
董伟峰等 丹磺酰氯作为生物胺柱前衍生试剂衍生化条件的研究 [ J] .大连轻工业 学院学报2005 Vol.24 No.2

缓冲溶液pH 值
生物胺和衍生剂在碱性环境下才能发生衍生
化反应, 选择一个合适的pH 体系很重要。 饱和碳酸氢钠的体系可以得到得到最大衍生 产物生成量。
衍生温度和时间
组胺 - 22.623
0.30
色胺 - 12.614
苯乙胺 - 14.860
0.40
内标1，7-二氨基庚烷 - 23.664
0.50
腐胺 - 16.336
尸胺 - 17.798
AU
精胺 - 30.014
葡萄酒样品谱图
0.20 0.18 0.16 0.14 0.12 0.10 0.08
色胺 - 12.356
60℃培养箱中反应30min，确定为最佳反应
温度和时间。实验重现性好。
26.00
亚精胺 - 27.458
28.00
1 - 25.663
30.00
32.00
34.00
36.00
38.00
40.00
42.00
44.00
注意问题:反应过程中决定作用的条件
衍生剂 浓度
缓冲溶 液pH 值
衍生温 度
衍生时 间
衍生剂浓度
不同浓度的Dns-Cl
对生物胺衍生效果不同， 实验显示5mg/mL对于本实验足够，高浓度的 Dns-Cl 只会造成试剂浪费。
流动相A为甲醇溶液，B为超纯水。
标准色谱图

1－色胺，2－β-苯乙胺，3－腐胺，4－尸胺， 5－组胺，6－1,7二氨基庚烷(内标)，7－酪胺， 8－精胺，9－亚精胺
计算
= A×f/V×1000 X——试样中生物胺的含量，单位为毫克每升 （mg/L）； A——试样中各组分生物胺对应的量，单位为 微克（μg）； f——试样稀释倍数； V——取样量，单位为毫升（mL）。

样品处理—衍生




取上述待衍生的试样溶液0.5mL 置10mL具塞试管中， 加入1.5mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0mL（5mg/mL丙酮） 丹磺酰氯衍生剂，振荡使混匀。 置60℃培养箱中反应30min，中间振荡2次，取出， 分别加入100µL谷氨酸钠（50mg/ml饱和碳酸氢钠溶 液），振荡混匀，60℃保温15min。 取出，每个试管中加入1mL超纯水，在40℃水浴用氮 气除去丙酮。加入3mL乙醚，振荡2min，静置分层后， 吸取出上层有机相（乙醚层），重复萃取2次，合并 乙醚萃取液，氮气吹干。 加入1.0mL甲醇使残留物溶解，振荡混匀，0.22µm微 孔滤膜过滤，滤液待测。
标准系列
分别移取0.5mL的1.0、2.5、5.0、10.0、
15.0、25.0、50.0 mg/L生物胺标准系列溶液， 分别置10ml具塞试管中。 依次加入20µL（100mg/L）内标使用液，加 入1.5mL饱和碳酸氢钠溶液、1.0mL （5mg/mL丙酮）丹磺酰氯衍生剂，振荡使混 匀。置60℃培养箱中反应30min，以下操作 同试样的衍生步骤。
样品处理—萃取
量取葡萄酒5mL，加入适量氯化钠使溶液饱和。 准确量取上述饱和后的试样提取液5mL，置于 15ml离心管中，用0.1mol/L NaOH溶液调节pH 至12.0。 加入5mL的正丁醇－氯仿(1:1)混合液，涡旋振荡 5min，3600r/min离心10min，吸取上层有机相， 再重复萃取2次，合并萃取液，混匀，取3mL萃 取液并加入0.2mL1mol/L HCl ，混合后40℃水 浴下氮气吹干，加入1mL 0.1mol/L HCl 复溶， 待衍生。
过量摄入的危害
当人体摄入过量的生物胺时，就会引起诸如
头痛、恶心、心悸、血压变化、呼吸紊乱等 过敏反应，严重的还会危及生命。 生物胺中以组胺对人体健康影响最大，海产 鱼中的青皮红肉鱼类含组胺较高，当鱼不新 鲜或腐败时，鱼体中游离的组胺酸经脱羧酶 作用产生组胺。
许多国家已经作出了葡萄酒中组胺的限量 范围。 澳大利亚、匈牙利和瑞士--10 mg/L 法国--8 mg/L 比利时--6 mg/L 荷兰--3.5 mg/L 德国--2 mg/L 我们国家鱼类中组胺的限量 鲐鱼—100mg/100g 其他含组胺的鱼类—30mg/100kg

葡萄酒中的生物胺
葡萄酒中的生物胺含量与葡萄品种、气候条件、 葡萄卫生状况、酒种、酿造工艺、储存条件等诸 多因素相关。 曾有报道研究了葡萄牙产区不同年份的葡萄酒中 生物胺变化 在2003 年的葡萄酒中，酪胺和异戊胺的含量较 高 在2004 年的葡萄酒中，腐胺为主要的生物胺 这 可能是由于不同年份气候条件的变化，自然的微 生物菌群与葡萄组分的不同而引起这种差异。
高效液相色谱法测定8种生物胺原理
生物胺自身没有荧光和紫外的发色基团,因此
需要经过衍生化处理，才能在色谱仪器检测 出来。 丹磺酰氯（Dns-Cl）可以和伯胺或仲胺基上 的活泼氢发生反应，脱掉一分子的HCl，生成 具有紫外和荧光的衍生物。
以1,7-二氨基庚烷为内标，经过氯仿－正丁醇
（1：1）液液萃取净化后，以丹磺酰氯为衍 生剂，60℃衍生30min，采用C18柱分离，紫 外检测器检测，外标法定量。