脂肪酶实验方案

脂肪酶实验方案

富集培养基( %) :酵母膏0. 02 , Na2HPO4 0.35 , K2HPO4 0. 15 , MgSO4·7H2O 0. 05 , NaCl 0.05 , 橄榄油1. 0 , pH 7. 0.

溴甲酚紫筛选平板分离培养基 ( %) : 牛肉膏0. 5 , 蛋白胨1. 0 , NaCl 0. 5 ,葡萄糖0. 3 ,聚乙烯醇1. 0 ,橄榄油2. 5 , 琼脂1. 5 ;灭菌后加入过滤灭菌的溴甲酚紫(50 mg/ 100 mL) 0. 4 mL , pH 6.

0 ,7.0 ,8. 0.

种子培养基( %) :葡萄糖 2. 0 , (NH4 ) 2SO4 0.5 , K2HPO4 0.

1 ,MgSO4·7H2O 0. 05 , 蛋白胨2. 5 ,橄榄油1. 0 , pH 7. 0.

发酵培养基( %) :蛋白胨2. 0 , 蔗糖0. 5 , 橄榄油1. 0 , (NH4 ) 2SO4 0. 1 , MgSO4 〃7H2O 0. 05 ,K2HPO4 0. 1 ,pH 自然

产脂肪酶菌株的筛选：将细菌接种到种子培养基上，于30 ℃,200 r/ min 摇床培养24 h，划线于溴甲酚紫筛选平板分离培养基上。观察已生长的菌落周围有无透明圈,有红色水解圈的菌落对应的菌株即为产脂肪酶菌株。

脂肪酶高产菌株的筛选：

（1）产脂肪酶菌株发酵培养：将产脂肪酶菌液按 1 %的接种量接入50 mL 发酵培养基中(250 mL 三角瓶) ,30 ℃,200 r/ min 摇床培养48 h；

（2）上清液的制备：经6000 rpm/min离心10 min，收集上清液，用0.20 μm滤膜对上清液过滤除菌，滤液分装后-20℃保存待用；（3）(i)度法测定各菌株产酶相对大小：在pH7.5, 30℃条件下, 每分钟释放 1 μmol 对-硝基酚( ρ- nitrophenol) 所需的酶量, 定义为一个活力单位。脂肪酶催化对- 棕榈酸硝基苯酯分解产生ρ- nitrophenol, 在该过程中不断测定其光吸收值的变化。根据单位时间产生ρ- nitrophenol 的量来反应脂肪酶的活力。（本实验采用如下方法：分别向各菌株等量上清液中加入等量过量的对- 棕榈酸硝基苯酯，在反应过程中不断测定其光吸收值的变化，根据吸光值变化幅度确定产酶量大小。）

[A液:16.5mmol/L的对硝基苯棕搁酸酯(p一NPP)的异丙醇溶液(冷藏，两周内使用)。B液:含有0.4%Trilonx一100和0.1%阿拉伯树胶的50mmol/L的Tris一HCI缓冲液(pH8.0)。测定时，将相应的A液与B液1:9混和，取100ul适当浓度的酶液加人900ul的上述混和液

中，混匀，37℃反应10min后，用可见分光光度计(410nm)读取A值。在此反应条件下，对硝基苯的消光系数是1.46x105cm3/mol。1个单位的脂肪酶活力定义为每分钟分解p一NPP并释放出1umol对硝基苯所需的酶量。]

(ii)平板法：采用三丁酸甘油脂平板鉴定法,鉴定板含 2 %的三丁酸甘油脂乳化液和2 %的琼脂粉。取10μl粗酶液加入鉴定板上各小孔(直径0. 20cm) 中,特定温度下放置12h 后,通过水解透明圈的直径大小来测定脂肪酶酶活性大小。

菌株产酶条件的优化

碳源对产酶的影响；分别选用葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉、麦芽糖、玉米粉、糊精、玉米淀粉、大豆油、橄榄油为碳源(均为 2 %) 进行发酵,以平板透明圈法测定其产酶情况。

氮源对产酶的影响；以 2 %糊精为碳源,分别选用蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、牛肉膏、硫酸铵、硝酸铵(均为3 %) 为氮源进行产酶实验。起始pH 值对产酶的影响：1 mol/ L 的HCl 和1 mol/ L 的NaOH 调节发酵培养基的初始pH 值, 分别为4. 0 ,5. 0 ,6. 0 , 7. 0 ,8. 0 和9. 0 ,在30 ℃下发酵2 d ,测定酶活,考察初始pH 值对酶活的影响. 结果显示,初始pH对产酶的影响很大,该菌株产酶的最佳起始pH 值在7. 0 左右,当pH 在9 的时候,菌体几乎不生长,产酶下降

温度对产酶的影响：优化的培养基,在不同温度下(24 ,26 ,28 ,30 ℃) 摇瓶发酵培养,寻找最佳的发酵温度. 菌株060805 在28 ℃下产脂肪酶最多

不同Mg2 + 浓度对产酶的影响；变发酵培养基中Mg2 + 的浓度,观察不同浓度的Mg2 + 对产酶的影响

脂肪酶的酶学特性

温度：脂肪酶酶促反应受温度影响很大, 在一定范围内温度升高反应速率加快, 一般来讲酶促反应的Q10为1～2。另一方面, 温度过高会使酶蛋白变性失活。大多数显示脂肪酶最佳温度范围介于30℃～40℃。（25～55 ℃范围内以5 ℃为梯度以分光光度法(下同) 测定酶活）

PH：脂肪酶的活力受pH 影响很大, pH 的变化可影响酶活性中心部位活性基团的解离, 从而影响到酶与底物的结合或催化底物转变为产物。经调查, 大多数脂肪酶最适pH 值6～9。（取一定量的纯化酶液与等体积的pH5. 0～11. 0 的各种缓冲液混匀,置于 4 ℃下存放

24h 后检测酶活(以未处理的酶液作为对照) ）

热稳定性：取20 mL 酶液分别置于40 、50 、60 、70 ℃恒温水浴处理60 min , 每隔10min 取样测定残留酶活力(以未经处理的酶液作对照) .（一定量的纯化酶液分别置于不同温度下恒温处理30min(以未处理的酶液为对照) 分光光度法(下同) 检测其酶活）

影响脂肪酶活力的活性因子：肪酶活性的影响因子很多, 包括各种金属离子和有机化合物及表面活性剂等物质。Ca2+和Mg2+、Na+、K+和Li+、Cu2+、Mn2+、Fe2+、Ba2+、Fe3+、Zn2+（取一定量的酶液分别与等体积10mmolPL 的各种金属离子及不同浓度的表面活性剂混匀,置于4 ℃下存放24h 后测定酶活(以未处理的酶液作为对照)）