河北北方学院 大三临床医学,分子诊断学期末考试题 生物大分子分离纯化

生物大分子的分离纯化

一、名词解释：

生物大分子（biomacromolecule）：生物体内由分子量较低的基本结构单位首尾相连形成的多聚化合物。

核蛋白（nucleoprotein）：细胞内的核酸包括DNA与RNA，均和蛋白质结合成为核蛋白。

蛋白质的纯度（purity）：一般指目的蛋白是否含其他杂蛋白，而不包括盐、缓冲液离子、SDS等小分子在内，一定条件下的相对均一性。二、问答题：

1.生物体中最重要的生物大分子有哪些？他们各自的生物学功能是什么？DNA、RNA和蛋白质是生物体中最重要的生物大分子。DNA和RNA是生物体的遗传物质，他们的最基本功能是储存并传递遗传信息。蛋白质是基因表达的产物，它是细胞组分中含量最丰富、功能最多的生物大分子，几乎全部生命过程及所有细胞（或病毒）活动都离不开蛋白质，蛋白质是一切生命活动的物质基础。

2、临床诊断常见的标本包括哪些？应从哪几方面进行考虑来选择适宜的分离和纯化核酸的方法？

临床诊断常见的标本包括血液、尿液、唾液、组织及培养的细胞。

（1）.不同的研究目的对核酸的完整性、纯度、产量及浓度可能有不同的要求。（2）.要考虑制备核酸所需的时间与成本。（3）．在不影响核酸制品质量与产量的前提下，应选择安全的试剂与制备方案。

3.分离与纯化核酸的技术很多，各具特点及适用范围，但不论采取何种方法，均应遵循总的原则，其内容是什么？

一是保持核酸碱基序列的完整性，因为完整的一级结构是核酸结构和功能研究以及基因诊断的最基本要求；二是尽量清除其他分子的污染，保证核酸制品的纯度，以满足后续研究及诊断的要求。

4.在核酸的分离与纯化过程中，应该清除的杂质主要包括哪三部分？

非核酸的大分子污染物，主要是蛋白质、多糖及脂类物质；非需要的核酸分子，指的是制备DNA时RNA为杂质，制备RNA时DNA为杂质，分离某一特定的核酸分子时，其他的核酸分子皆为杂质；分离纯化过程中前后加入的对后续研究与诊断有影响的溶液及试剂，一些有机溶剂和某些金属离子要很好地剔除。

5.浓缩核酸最常用且高效的方法是什么？其优点是什么？

沉淀是浓缩核酸最常用的方法。优点：①核酸沉淀后，可以很容易将核酸溶液调至所需浓度；②能清除部分杂质和某些盐离子。

6.核酸的有机溶剂沉淀法的原理是什么？

核酸在水溶液中以多聚阴阳离子的化合物形式存在，它与1价或2价阳离子形成盐，通过屏蔽带负电的磷酸基团，使DNA、RNA分子聚集在一起而不溶于许多有机溶剂。因此常在加入一定浓度的盐后，用有机溶剂沉淀抽提液中的核酸。常用的盐类有NaAc、 KAc 、NH4Ac、 MgCl2、KCl、NaCl，常用的有机溶剂为乙醇、异丙醇和聚乙二醇。核酸沉淀中常含有少量共沉淀的盐，需用70%-75%的乙醇洗涤去除。

7.紫外分光光度法测定核酸浓度的原理是什么？具体的换算关系是什么？灵敏度是多少？

原理：核酸分子中的碱基具有共轭双键结构，因而可吸收紫外线，最大吸收波长为260nm。在波长260nm紫外光下，1.000A260（1OD值）的吸光度相当于50μg/ml

双链DNA；1.000A260=33μg/ml单链DNA ；1.000A260= 40 ug/ml单链RNA 。此法测定核酸的灵敏度为0.25μg/ml。

8.紫外分光光度法测定核酸浓度的原理是什么？灵敏度是多少？

核酸的荧光染料溴化乙锭（EB），嵌入碱基平面，在UV激发下发出红色荧光，且荧光强度的积分与溶液中核酸的含量呈正比。该法灵敏度高达1-5ng,适合低浓度溶液的定量分析。

9.采用紫外分光光度法如何对核酸制品的纯度进行鉴定？（填空）

紫外分光光度法主要通过A260与A280的比值来判断有无蛋白的污染。在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280应为1.8，纯RNA的比值为2.0。比值的升高与下降均提示不纯。

10.如何采用琼脂糖凝胶法对核酸的完整性进行鉴定？

以EB为示踪剂，基因组DNA片段的分子量很大，在电场中泳动很慢，如果发生降解，电泳图呈拖尾状。完整的或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带的荧光强度积分呈特定的比值，沉降系数大的核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分低。一般而言，28s (23s) RNA 荧光强度约为 18s (16s)的2倍，否则提示有RNA的降解。若在加样孔附近有着色条带，说明有DNA的污染。

11.酚抽提法提取哺乳动物细胞基因组DNA所需试剂及过程是怎样的？

以含EDTA、SDS及无DNase的RNase裂解液裂解细胞，经蛋白酶K处理后，用pH8.0的Tris饱和酚抽提DNA，重复抽提至一定浓度后，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得DNA粗制品。

12.酚抽提法涉及到的主要试剂有哪些？他们的作用是什么？

裂解缓冲液中的EDTA：二价金属离子螯合剂，可抑制DNase的活性，同时降低细胞膜稳定性

SDS：阴离子去垢剂，主要溶解细胞膜、核膜，并乳化脂质、膜蛋白及胞内蛋白，并使他们沉淀变性，并将组蛋白和非组蛋白从DNA分子上拉开，同时兼备变性DNase的作用

无DNase的RNase：可高效水解RNA而避免DNA的消化。

蛋白酶K：广谱蛋白酶，在SDS存在下保持很高的活性，可以消化DNA酶和胞内的蛋白质。

酚：变性沉淀蛋白质，也抑制DNA酶活性。

pH8.0的Tris溶液：能保证抽提时DNA进入水相，而避免留在蛋白质的沉淀层，同时pH8.0可防止DNA变性。

13.纯化与回收所需要的DNA片段需要注意的原则是什么？

两个原则：提高片段的回收率；清除回收的DNA样品中的杂质。

14.从琼脂糖凝胶中回收DNA片段的方法主要有哪些？

二乙基氨基乙基-纤维素膜插片电泳法、电泳洗脱法、冷冻挤压法及低熔点琼脂糖凝胶挖块回收法等。

15.从聚丙烯酰胺凝胶中回收DNA片段的标准方法是怎样的？

标准方法是压碎与浸泡法。他是将含待回收DNA条带的凝胶块切出，用吸头或接种针将其压碎，然后以洗脱缓冲液浸泡，使DNA洗脱出来。

16.质粒DNA的提取与纯化的经典方法包括哪些？这些方法主要包括哪三个步骤？

经典的方法有碱裂解法、煮沸裂解法和SDS裂解法。这些方法主要由质粒DNA