完整版实时荧光定量PCR实验结果分析
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利用TaqMan 技术研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异
RNA提取 RNA定量 反转录(RT) 设计qPCR实验方法 RT-qPCR实验
结果分析
实验设计流程
Aurum Total RNA kit
iScript cDNA Synthesis Kit
材料和方法
? 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常， 因此可以作为一个检测标准
A.Multiplex Reactions
Healthy RNA 28.48 28.68 28.78 28.65± 0.15
Carcinoma 26.42 26.98 26.98 26.80 ± 0.32
B.Singleplex reactions
Healthy RNA 28.67 28.71 28.73 28.70 ± 0.03
PCR 优化-扩增曲线
}Real annealing range
?目标基因：
未知样品
?生成标准曲线： 标准品梯度
?监控系统故障： 阳性对照??
?监控污染：
阴性对照/基因组对照??
?校准生物学误差：看家基因?? ?降低其余误差： 重复实验
? 95Co,15min ? 94Co,15sc
? 60Co,1min ? plat rad
△ C（t）GOI- △ C（t）ref= △C（t） △ C（t）sample- △ C（t）calibrator = △ △C（t）
?好处：不做标准曲线
?应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一
致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估） ；不要求很高的精度
应用实例-基因表达分析
? go to stp 3,39 ? 10C,oforvr
? End
mor
tims
RT-qPCR 实验
Color 1 – FAM detection for ERBB2
Color 2 - VIC detection for GAPDH
结果分析-绝对曲线
结果分析-单双通道相互验证
ERBB2单双通道相互验证的实验结果
相对定量数据处理
?管家基因校准(Normalization Gene)
–得出每个细胞中的[目的基因] –目标基因vs. 管家基因
?对照样品校准(Calibrator Sample) –得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample. –处理的vs. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常….
Intact
7 hr. at 90°C
Intact
5 hr. degradation
GAPDH gene
Intact
7 hr. degradati
on
Experion? RNA HighSens Chip
0.1-5 ng/ml 100-6,000 nt
Experion? RNA StdSens Chip 5-500 ng/ml 100-6,000 nt
一步法＆两步法
在不同的反 应管中运行 RT & PCR
1. 反转录反应 加热灭活反转酶
1.反转录反应
iScript cDNA Synthesis Kit
1. 25°C 5 min 2. 42°C 30 min 3. 85°C 5 min 4. 冷却至4°C
2. PCR 反应
2. PCR 反应
设计qPCR 实验方法
–应用：病毒拷贝数；转基因的
拷贝数；转基因成分百分含量检 测
相对定量:How Much –优点：需要/不需要标准品； 使用广泛 –缺点：数据理解困难
–应用：差异表达分析；芯片评
估
14500 copies
2.5 2
1.5 1
0.5 0
Normal
Treatment A
Treatment B
绝对定量
108 106
104 102
绝对定量
108 106
104 102
T
绝对定量
绝对定量
108 106
104 102
T
绝对定量
105 copies/well
相对定量
1/3 1/3 1/3 1/3
Blank
10.0 ng/2ul
1.11 ng/2ul
0.12 ng/2ul
3.33 ng/2ul
0.37 ng/2ul
Carcinoma 27.09 26.68 26.70 26.82 ± 0.24
样品扩增：正常 vs肿瘤
结果分析-扩增曲线
1. 定性条件摸索
2. 荧光化学物质
? SYBR GREEN染料 ? Taqman探针
3. 定量PCR条件优化
4. 单双通道相互验证
? Fam标记目标基因探针 ? VIC标记看家基因探针
PCR 优化-温度确定
动态温度梯度
10oC Above 预设退火温度 5-6oC Below
PCR 优化-熔解曲线
实时荧光定量 PCR实验结果
分析
邓椋爻 技术支持 广州市昊洋贸易有限公司
? 定量分析 ?绝对定量 ?相对定量
定量PCR 应用
? 定性分析 ?SNP分析，基因扫描 ?阴阳性判定 ?熔解曲线分析
绝对定量与相对定量
绝对定量：How Many –优点：给出目标基因初始模板 的绝对数量，数据容易处理 –缺点：必须有标准品，做标准 曲线
? 选用GAPDH作为内标基因 －FAM标记的ERBB2探针 －VIC标记的GAPDH探针
? 标准品（质粒）构造标准曲线 ? 多重PCR反应 ? 阴性对照
－无RNA对照（空白） －无逆转录酶对照（监控基因组污染）
RNA 定性及定量分析
正常乳腺组织 RNA
Intact
5 hr. at 90°C
乳癌组织 RNA
Control C T = 21.3
Sample A
CT = 22.8
Sample B
CT = 19.3
T
相对定量
源自文库
相对定量
Control C T = 21.3
Sample A
CT = 22.8
= 1.5ng / tube = 0.5ng / tube
? ?
dloF
1 0.33
Sample B
CT = 19.3 = 6.0ng / tube ? 4
目标基因 管家基因
ERBB2 GAPDH
Sample 处理后 Calibrator 处理前
相对定量
相对定量——标准曲线
?按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度 ?至少需要两个标准曲线
?GOI ?rfrnc gn
?标准曲线确定反应扩增效率
相对定量：?? CT法
?依据：平均相对含量% = 2 –平均ΔΔCT ?数据处理：
RNA提取 RNA定量 反转录(RT) 设计qPCR实验方法 RT-qPCR实验
结果分析
实验设计流程
Aurum Total RNA kit
iScript cDNA Synthesis Kit
材料和方法
? 已知在50%的乳腺肿瘤样本中，ERBB2表达异常， 因此可以作为一个检测标准
A.Multiplex Reactions
Healthy RNA 28.48 28.68 28.78 28.65± 0.15
Carcinoma 26.42 26.98 26.98 26.80 ± 0.32
B.Singleplex reactions
Healthy RNA 28.67 28.71 28.73 28.70 ± 0.03
PCR 优化-扩增曲线
}Real annealing range
?目标基因：
未知样品
?生成标准曲线： 标准品梯度
?监控系统故障： 阳性对照??
?监控污染：
阴性对照/基因组对照??
?校准生物学误差：看家基因?? ?降低其余误差： 重复实验
? 95Co,15min ? 94Co,15sc
? 60Co,1min ? plat rad
△ C（t）GOI- △ C（t）ref= △C（t） △ C（t）sample- △ C（t）calibrator = △ △C（t）
?好处：不做标准曲线
?应用范围：扩增效率较高，目标基因和内标基因扩增效率一
致并且相互独立扩增；不做标准曲线，高通量检测（芯片评估） ；不要求很高的精度
应用实例-基因表达分析
? go to stp 3,39 ? 10C,oforvr
? End
mor
tims
RT-qPCR 实验
Color 1 – FAM detection for ERBB2
Color 2 - VIC detection for GAPDH
结果分析-绝对曲线
结果分析-单双通道相互验证
ERBB2单双通道相互验证的实验结果
相对定量数据处理
?管家基因校准(Normalization Gene)
–得出每个细胞中的[目的基因] –目标基因vs. 管家基因
?对照样品校准(Calibrator Sample) –得出相对于某个样品的基因表达量, 1X sample. –处理的vs. 未处理的，6hr vs. 0 hr, 病理vs. 正常….
Intact
7 hr. at 90°C
Intact
5 hr. degradation
GAPDH gene
Intact
7 hr. degradati
on
Experion? RNA HighSens Chip
0.1-5 ng/ml 100-6,000 nt
Experion? RNA StdSens Chip 5-500 ng/ml 100-6,000 nt
一步法＆两步法
在不同的反 应管中运行 RT & PCR
1. 反转录反应 加热灭活反转酶
1.反转录反应
iScript cDNA Synthesis Kit
1. 25°C 5 min 2. 42°C 30 min 3. 85°C 5 min 4. 冷却至4°C
2. PCR 反应
2. PCR 反应
设计qPCR 实验方法
–应用：病毒拷贝数；转基因的
拷贝数；转基因成分百分含量检 测
相对定量:How Much –优点：需要/不需要标准品； 使用广泛 –缺点：数据理解困难
–应用：差异表达分析；芯片评
估
14500 copies
2.5 2
1.5 1
0.5 0
Normal
Treatment A
Treatment B
绝对定量
108 106
104 102
绝对定量
108 106
104 102
T
绝对定量
绝对定量
108 106
104 102
T
绝对定量
105 copies/well
相对定量
1/3 1/3 1/3 1/3
Blank
10.0 ng/2ul
1.11 ng/2ul
0.12 ng/2ul
3.33 ng/2ul
0.37 ng/2ul
Carcinoma 27.09 26.68 26.70 26.82 ± 0.24
样品扩增：正常 vs肿瘤
结果分析-扩增曲线
1. 定性条件摸索
2. 荧光化学物质
? SYBR GREEN染料 ? Taqman探针
3. 定量PCR条件优化
4. 单双通道相互验证
? Fam标记目标基因探针 ? VIC标记看家基因探针
PCR 优化-温度确定
动态温度梯度
10oC Above 预设退火温度 5-6oC Below
PCR 优化-熔解曲线
实时荧光定量 PCR实验结果
分析
邓椋爻 技术支持 广州市昊洋贸易有限公司
? 定量分析 ?绝对定量 ?相对定量
定量PCR 应用
? 定性分析 ?SNP分析，基因扫描 ?阴阳性判定 ?熔解曲线分析
绝对定量与相对定量
绝对定量：How Many –优点：给出目标基因初始模板 的绝对数量，数据容易处理 –缺点：必须有标准品，做标准 曲线
? 选用GAPDH作为内标基因 －FAM标记的ERBB2探针 －VIC标记的GAPDH探针
? 标准品（质粒）构造标准曲线 ? 多重PCR反应 ? 阴性对照
－无RNA对照（空白） －无逆转录酶对照（监控基因组污染）
RNA 定性及定量分析
正常乳腺组织 RNA
Intact
5 hr. at 90°C
乳癌组织 RNA
Control C T = 21.3
Sample A
CT = 22.8
Sample B
CT = 19.3
T
相对定量
源自文库
相对定量
Control C T = 21.3
Sample A
CT = 22.8
= 1.5ng / tube = 0.5ng / tube
? ?
dloF
1 0.33
Sample B
CT = 19.3 = 6.0ng / tube ? 4
目标基因 管家基因
ERBB2 GAPDH
Sample 处理后 Calibrator 处理前
相对定量
相对定量——标准曲线
?按比例稀释标准品，根据标准曲线确定样本初始模板浓度 ?至少需要两个标准曲线
?GOI ?rfrnc gn
?标准曲线确定反应扩增效率
相对定量：?? CT法
?依据：平均相对含量% = 2 –平均ΔΔCT ?数据处理：