乙肝病毒耐药基因测序 PPT课件
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乙肝耐药基因测序特点
基因芯片和基因测序方法检测乙肝耐药位点的比较
原理
结果 分析
基因芯片
基因测序
标本DNA与耐药 检测探针的DNA 杂交
由显色结果判断 野生株与突变株
双脱氧终止法检测基 因序列
SAP MIX的作用
外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残 留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR 产物中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团， 从而达到纯化定量PCR产物的目的。
经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方 可以进行后面的测序PCR反应。
测序PCR循环条件
96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25
毛细管电泳原理
一、电进样与电泳 毛细管和电极深入样品溶液中， 加电压，荷负电的DNA分子进入 毛细管，在电场作用下向阳极泳动。
二、荧光激发和检测
带4色荧光标记的DNA片段按分子量 从小到大依次经过激光检测区，激光激 发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光 信号被CCD收集，软件将光学信号转 换成电泳图谱。
HBV野生型质控的测序峰图
↑ 173位点
↑
↑
180位点 181位点
↑ 184位点
↑ 202位点
↑ 204位点
↑ 207位点
↑ 236位点
↑
↑
237位点 238位点
↑ 250位点
↑
↑
↑
213位点 214位点 215位点
rtM204V/I/S 的几种基因型
↑ 204位点（YMDD）
↑ 204位点（YVDD）
由碱基序列与氨基酸 序列判断
↑ 204位点
由上图204位点可见，存在GTG、ATG、ATT三种碱基排列 状况，分别对应V、M、I三种氨基酸，为YMDD/YVDD/YIDD杂 合子，测序结果直观可靠。
相较于基因芯片检测，基因测序法具有直观，准确的 优点，也避免了DNA杂交可能发生的污染，假阴性，假阳 性问题。对于杂合子，也就是野生型与突变型共存的状况， 更直观可靠。
一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变 异），大多数患者会在2-4个月之内出现 HBV-DNA和A德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物， 可明显抑制HBV DNA复制
• HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3 年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、 3.1%
• HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分 别为0%、3.0%、5.9%~11%
测序 ，定量PCR产物经过SAP MIX的纯化后， 进行测序PCR反应。
普通PCR与测序PCR反应的比较
DNA 聚合酶 引物 底物
产物
荧光标记
普通PCR Taq 酶 一对 dNTP 等长的DNA片段 无
测序PCR反应 （双脱氧终止法） 测序酶
单向
dNTP+ddNTP(带 荧光标记) 相差一个碱基的一 系列片段 3’端带荧光标记
↑
204位点
由上图204位点可见，有GTG弱势突变株存在，属于 YVDD与野生型共存的状况，基因测序可以较早发现突变株 的存在。
乙肝病毒耐药位点检测的临床应用
HBV拉米夫定耐药
使用一年、二年、三年、四年的耐药比 率为：15-32%、38%、56%、67%
虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著， 但长期使用拉米夫定会出现耐药现象
HBV恩替卡韦耐药
• 拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性 降低8至30倍；
• 本资料来源于 网址： /Article/ygfz/ygzl/200211/1159.html
上海申友乙肝病毒DNA测序试剂盒检测的 耐药位点
拉米夫定（LAM）阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV) 替比夫定 （LDT)
rtV173L
rtA181V/T/S rtT184A/I/S rtL180M
• HBV DNA 的提取 • 定量PCR反应 （ HBV DNA ≥
5×103 IU/ml 的标本可以进行测序） • PCR产物的酶解（SAP酶混合物） • 测序PCR反应 （双脱氧终止法） • 测序产物纯化 （乙醇纯化法） • 上机测序 （毛细管电泳） • 测序峰图分析
双脱氧终止法原理
病毒DNA定量分析得到HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行后续的耐药基因
↑ 204位点（YIDD）
耐药突变位点命名
• 命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、 间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位 码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含 344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区， 包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分， 即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如 rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被 蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐 药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。
乙肝病毒耐药基因测序
DNA测序技术原理
乙肝病毒结构
美国ABI3130型基因测序仪
本实验采用核酸扩增技术结合
荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎 病毒DNA进行定量检测，其产物经 过测序PCR反应，产物纯化后上 3130测序仪进行毛细管电泳，得到 测序峰图，从而完成耐药突变位点 的检测。
乙肝病毒P区耐药基因测序步骤
cycles →4℃恒温。
60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR 最大差别，目的是为了扩增出一系列相差 一个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。
测序反应得到的产物经过酒精纯化， 甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电 泳。
酒精纯化的目的是去除未结合的荧光 染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。 此步对测序成功非常关键，关系到测序峰 图质量的好坏。
rtL180M
rtM204V/I/ S
rtV214A rtQ215S rtN236T
rtS202G/I rtM204V/I rtM204V/I/S /S
rtM250L/V
rtV207I/L/G rtP237H
rtS213T
rtN/H238T/
D
复制DNA序列于NCBI基因分型网页上，就可 得到乙肝病毒基因分型结果。
乙肝耐药基因测序特点
基因芯片和基因测序方法检测乙肝耐药位点的比较
原理
结果 分析
基因芯片
基因测序
标本DNA与耐药 检测探针的DNA 杂交
由显色结果判断 野生株与突变株
双脱氧终止法检测基 因序列
SAP MIX的作用
外切酶Exon I 降解定量PCR产物中残 留的单链PCR引物。SAP酶除去定量PCR 产物中残存的脱氧核苷三磷酸的磷酸基团， 从而达到纯化定量PCR产物的目的。
经过SAP MIX 酶解纯化后的定量产物方 可以进行后面的测序PCR反应。
测序PCR循环条件
96℃ 1min → (96℃ 10sec , 50℃ 5sec , 60℃ 4min) ×25
毛细管电泳原理
一、电进样与电泳 毛细管和电极深入样品溶液中， 加电压，荷负电的DNA分子进入 毛细管，在电场作用下向阳极泳动。
二、荧光激发和检测
带4色荧光标记的DNA片段按分子量 从小到大依次经过激光检测区，激光激 发荧光，产生长波长的荧光信号，荧光 信号被CCD收集，软件将光学信号转 换成电泳图谱。
HBV野生型质控的测序峰图
↑ 173位点
↑
↑
180位点 181位点
↑ 184位点
↑ 202位点
↑ 204位点
↑ 207位点
↑ 236位点
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↑
237位点 238位点
↑ 250位点
↑
↑
↑
213位点 214位点 215位点
rtM204V/I/S 的几种基因型
↑ 204位点（YMDD）
↑ 204位点（YVDD）
由碱基序列与氨基酸 序列判断
↑ 204位点
由上图204位点可见，存在GTG、ATG、ATT三种碱基排列 状况，分别对应V、M、I三种氨基酸，为YMDD/YVDD/YIDD杂 合子，测序结果直观可靠。
相较于基因芯片检测，基因测序法具有直观，准确的 优点，也避免了DNA杂交可能发生的污染，假阴性，假阳 性问题。对于杂合子，也就是野生型与突变型共存的状况， 更直观可靠。
一旦出现拉米夫定耐药突变（YMDD变 异），大多数患者会在2-4个月之内出现 HBV-DNA和A德福韦为5’-单磷酸脱氧阿糖腺苷类似物， 可明显抑制HBV DNA复制
• HBeAg阳性慢性乙型肝炎患者，1、2、3 年时的耐药发生率分别为0%、1.6%、 3.1%
• HBeAg阴性者1、2、3年的耐药发生率分 别为0%、3.0%、5.9%~11%
测序 ，定量PCR产物经过SAP MIX的纯化后， 进行测序PCR反应。
普通PCR与测序PCR反应的比较
DNA 聚合酶 引物 底物
产物
荧光标记
普通PCR Taq 酶 一对 dNTP 等长的DNA片段 无
测序PCR反应 （双脱氧终止法） 测序酶
单向
dNTP+ddNTP(带 荧光标记) 相差一个碱基的一 系列片段 3’端带荧光标记
↑
204位点
由上图204位点可见，有GTG弱势突变株存在，属于 YVDD与野生型共存的状况，基因测序可以较早发现突变株 的存在。
乙肝病毒耐药位点检测的临床应用
HBV拉米夫定耐药
使用一年、二年、三年、四年的耐药比 率为：15-32%、38%、56%、67%
虽然拉米夫定治疗慢性乙肝疗效显著， 但长期使用拉米夫定会出现耐药现象
HBV恩替卡韦耐药
• 拉米夫定耐药的病毒株对恩替卡韦敏感性 降低8至30倍；
• 本资料来源于 网址： /Article/ygfz/ygzl/200211/1159.html
上海申友乙肝病毒DNA测序试剂盒检测的 耐药位点
拉米夫定（LAM）阿德福韦（ADV） 恩替卡韦（ETV) 替比夫定 （LDT)
rtV173L
rtA181V/T/S rtT184A/I/S rtL180M
• HBV DNA 的提取 • 定量PCR反应 （ HBV DNA ≥
5×103 IU/ml 的标本可以进行测序） • PCR产物的酶解（SAP酶混合物） • 测序PCR反应 （双脱氧终止法） • 测序产物纯化 （乙醇纯化法） • 上机测序 （毛细管电泳） • 测序峰图分析
双脱氧终止法原理
病毒DNA定量分析得到HBV DNA ≥ 5×103 IU/ml 的标本可以进行后续的耐药基因
↑ 204位点（YIDD）
耐药突变位点命名
• 命名体系将HBV聚合酶蛋白划分成4个区域：终蛋白区、 间蛋白区、rt区和RNA酶区，每个区的氨基酸分别计算位 码。rt区起始于高度保守的EDWGPC DEHG位点，包含 344个氨基酸，拉米夫定治疗相关的变异主要发生在该区， 包括rtL180M和rtM204V/I等。新命名体系包括4个部分， 即所属区域、治疗前氨基酸、变异位码和变异氨基酸，如 rtL180M表示变异发生在rt区的180位点，亮氨酸（L）被 蛋氨酸（M）所取代。应当指出的是，发生变异不一定耐 药，只有当变异株成为优势株时才发生耐药。
乙肝病毒耐药基因测序
DNA测序技术原理
乙肝病毒结构
美国ABI3130型基因测序仪
本实验采用核酸扩增技术结合
荧光标记探针杂交方法对乙型肝炎 病毒DNA进行定量检测，其产物经 过测序PCR反应，产物纯化后上 3130测序仪进行毛细管电泳，得到 测序峰图，从而完成耐药突变位点 的检测。
乙肝病毒P区耐药基因测序步骤
cycles →4℃恒温。
60℃ 4min的延伸时间是与普通PCR 最大差别，目的是为了扩增出一系列相差 一个碱基的ddNTP末端终止的DNA序列。
测序反应得到的产物经过酒精纯化， 甲酰胺变性之后，可以上机进行毛细管电 泳。
酒精纯化的目的是去除未结合的荧光 染料终止物和残留的引物、盐离子、酶等。 此步对测序成功非常关键，关系到测序峰 图质量的好坏。
rtL180M
rtM204V/I/ S
rtV214A rtQ215S rtN236T
rtS202G/I rtM204V/I rtM204V/I/S /S
rtM250L/V
rtV207I/L/G rtP237H
rtS213T
rtN/H238T/
D
复制DNA序列于NCBI基因分型网页上，就可 得到乙肝病毒基因分型结果。