核酸杂交技术

一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，
即印迹（blotting）。
固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的
温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。
Southern印迹杂交的基本步骤：
① 待测DNA样品的限制性内切酶消化
② 酶切DNA样品的电泳分离
③ 凝胶中DNA的变性和Southern转移
液相杂交后过量的未杂交探针在溶液中除去较困 难，同源与异源的DNA分子在杂交的过程中会发生 竞争，使得杂交结果的分析十分困难。 因此液相杂交应用较少
三、原位杂交
应用核酸探针与组织或细胞中的
核酸按碱基配对原则进行特异性结合形成
杂交体，然后应用组织细胞化学或免疫组
织化学方法在显微镜下进行细胞内定位或
辣根过氧化物酶催化的化学发光反应
4．多探针检测
• 采用发色体检测的最大益处是可同时检测一个以上的 杂化分子 • 每种探针分别用不同的报告基团如生物素、荧光素和 地高辛标记并同时与固定在滤膜上的核酸杂交 • 采用不同的链霉抗生素或抗体-酶和相应底物组合
第二节
经典的核酸分子杂交技术
核酸分子杂交分类
④ 探针的制备
⑤ Southern杂交 ⑥ 杂交结果的检测
限制性内切酶消化
酶切DNA样品的电泳分离
凝胶中DNA带被 转移到NC膜上
Southern印迹 凝胶中DNA 的NaOH变 性
凝胶中DNA分离带
标记 探针 杂交
探针杂交带曝光显 影
Southern杂交的应用
应用 单基因遗传病的基因诊断 基因点突变的检测 临床应用－－用于下列疾病的产前诊断 镰型细胞贫血 苯丙酮酸尿症 珠蛋白合成障碍性贫血 假肥大型肌营养不良 血友病 慢性进行型舞蹈病
杂交的特异性。
（二）探针的长度
1.DNA和RNA探针 DNA探针通常为400～500个碱基 2. 寡核苷酸探针 探针的最小长度取决于其靶序列的复杂性
（三）核酸探针的标记
1. 探针标记物的选择
（1）放射性标记 （2）非放射性标记 根据标记物掺入情况可分为均匀标记和 末端标记探针。
不同标记类型探针的比较：
第四章
核酸杂交技术
目 录
第一节 核酸分子杂交的概念
一、核酸探针
二、分子杂交信号检测
第二节 经典的核酸分子杂交技术
一、固相杂交
二、液相杂交
目 录
第四节 影响杂交信号检测的因素
一、探针的选择
二、探针的标记方法
三、探针的浓度 四、杂交率 五、杂交温度 六、杂交的严格谨性 七、杂交反应时间 八、杂交促进剂
（1）DNA随机引物标记
随机引物：含有各种可 能排列顺序的寡核苷酸 片段的混合物。
DNA聚合酶ⅠKlenow片段： 保留 5’→3’DNA聚合酶 活性 , 弱 3’→5’外切酶 活 性 ， 无 5’→3’ 外 切 酶活性。
（2）DNA切口平移标记
5′ 3′
DNase I，Mg2+
dATP，dGTP， dTTP
碱性磷酸酶显色反应示意图
(DAB)
(TMB)
HRP酶显色反应示意图
（2）间接检测
检测含地高辛、荧光素或生物素标记的探针时， 就要增加一个将酶连接到杂化核酸分子上的步骤。
Dig：半抗原，可通过抗原抗体反应系统与显色体系偶联
Dig-DNA探针 + 抗Dig抗体
-碱性磷酸酶
（或辣根过 氧化物酶）+ 底物
Southern印迹杂交（Southern blot hybridization/ Southern blotting）是指DNA与 DNA分子之间的杂交。
可用于基因组DNA的定性与定量分析，重组质粒
和噬菌体的分析等。
（二）Southern印迹杂交
包括两个主要过程：
将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到
一、核酸探针
核酸探针指能与靶核酸序列发生 碱基互补杂交，并能由其标记被特异 性检测的核酸分子。
（一）常用探针的种类
寡核苷酸探针
DNA探针
探针的种类 RNA探针
基因组DNA探针
cDNA探针
1. DNA探针 最常用的核酸探针 三大优点：
① 这类探针大多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，制备 方法简便； ② DNA探针相对不易被降解，一般DNA酶活性能有效地
（一）反向点杂交
反向点杂交（reverse dot blot, RDB） • 是将多种探针固定在同一膜上，同时参与检测的 样品DNA又互不干扰， 故能一次性筛查出多种 不同的序列。 • 特点：简单、快捷、特异性强、稳定性好 • 较Northern blot省去了电泳和毛细转膜过程
（二）Southern印迹杂交
根据杂交核酸分子的种类 • DNA与DNA杂交 • DNA与RNA杂交 • RNA与RNA杂交 根据杂交探针标记 • 同位素杂交
• 非同位素杂交
根据杂交介质
• 液相杂交
• 固相杂交 • 原位杂交
菌落杂交
Southern印迹杂交 Northern印迹杂交 点杂交 狭缝杂交
分子杂交技术一般过程
☆ 探针制备及标记（同位素或非同位素）
☆ 待测核酸样品制备（分离，纯化）
☆ 杂交（液相，固相，原位杂交）
☆ 杂交后处理（去掉非特异杂交分子）
☆ 显示结果（显色，发光，放射自显影） ☆ 结果分析
固相杂交：
先将待测单链核酸样品结合到固相支持物（常用有 硝酸纤维素滤膜、尼龙膜、化学活化膜等）上，然 后与溶液中的已知序列的标记探针进行杂交，放射 自显影分析杂交结果。
2.探针标记方法的选择 制备探针步骤：
探针标记
清除未标记的核酸探针 检测探针标记效率
核酸探针的标记方法
(1) DNA切口平移标记法 (2) DNA随机引物标记法 (3) DNA的末端标记 (4) cDNA探针的标记 (5) 寡核苷酸探针的标记 (6) 单链DNBiblioteka Baidu探针的标记 (7) RNA探针的标记
1. RNA病毒的检测
2. 基因表达的检测 Northern印迹技术被认为是检测基因表达 水平的金标准。
二、液相杂交
液相杂交是指待测核酸和探针都存在于杂交液 中，探针与待测核酸在液体环境中按照碱基互补配 对形成杂交分子的过程。
液相杂交
一种研究最早且操作简便的杂交类型。
原理和反应条件与固相杂交基本相同，仅是将待 检测的核酸样品和杂交探针同时溶于杂交液中进行 反应。
32P-标记的DNA
切口最终位置
(3) DNA的末端标记
1) DNA的5′末端标记
条件是有5’-OH存在，人工合成寡核苷酸最常用；双链 DNA需用碱性磷酸酶切除5’-P后再标记 5′p-HO-CpGpTpA……3′ 碱性磷酸酶
5′HO-CpGpTpA……3′
T4噬菌体多核苷酸激酶 [γ -32P]-ATP
DNA聚合酶I [α-32P]-dCTP
3′ 5′ DNA 酶 Ⅰ ： 在 双 链 DNA 上 随 机 打开 若 干 个单 链 缺 口 ， 产 生 3’-OH 端。 大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ ： 5’→3’DNA 聚 合 酶 活 性 ； 5’→3’ 外 切 核酸酶活性。
32P-部分标记的
变性
单链DNA片段 切口原始位置
5′32p-O-CpGpTpA……3′
37℃，反应10min, γ -32P-ATP 需150 μ ci/反应
2)
5′ 3′
DNA的3′末端标记
3′ 5′ 限制性内切酶 3′ 完整双链DNA
5′
5′ 3′
5′
3′
5′末端突出的 3′ 5′ DNA Klenow DNA聚合酶 [α -32P]-dNTP 其他3 种dNTP 3′ 3′末端标记的 5′ DNA 变性 3′ 32P-末端标记的 5′ 单链DNA探针
核酸分子杂交 (molecular hybridization of nucleic acid)
核酸分子杂交：单链的核酸分子在合适的条 件下，与具有碱基互补序列的异源核酸形成双 链杂交体的过程。 核酸分子杂交技术：利用核酸分子杂交检测 靶序列的一类技术称核酸分子杂交技术。 核酸分子杂交技术目前应用广泛，是定性或 定量检测特异RNA或DNA序列片段的有力工具。
2.液体闪烁计数法
液体闪烁计数法的工作原理是被测样
品辐射发出的辐射能经溶剂分子传递给闪
烁剂分子，当被激发的闪烁剂分子从激发
态退激为稳态时，以荧光光子的形式辐射
能量，经光电倍增管放大并被测量，就可
以实现对放射性核素的测定。
（二）非放射性标记探针的杂交检测
1.酶促显色检测
（1）直接检测 酶本身作为标记分子掺入到核酸中去，在洗脱后 就可直接进行检测。 酶直接作用于显色的底物，产生颜色沉淀，显色 沉淀可用肉眼检测。 酶直接作用于化学发光的底物发光, 发光的检测 要依赖于对蓝光敏感的X胶片。 这种检测法常用于寡核苷酸探针杂交，这类杂交 反应温度低。
二、分子杂交信号检测
（一）放射性标记探针检测 1、放射自显影 2、液体闪烁计数法 （二）非放射性标记探针的杂交检测 1、酶促显色检测 2、荧光检测 3、化学发光检测 4、多探针检测
（一）放射性标记探针检测
1.放射自显影
放射性杂交的检测基于放射性核素释放的 能量将照片纸感光的原理。 用32P标记杂交最常用的检测方法是放射自 显影。
基因表达的检测技术。
（一）基本操作步骤：
① 杂交前准备：保持细胞形态结构、保存核酸、 增加组织的通透性、减低背景。 ② 杂交：使探针与细胞中的把序列结合。
③ 杂交后处理：盐溶液的漂洗，以减少背景。
④ 显示：根据核酸探针标志物的种类选择相应 的检测系统。
（二）原位杂交的应用
1. 细胞遗传学分析 • 产前诊断 • 生殖医学中的应用 • 血液疾病中染色体易位的检测 • 实体瘤研究 2. 比较基因组杂交 3. 基因图谱绘制 4. 病原学检测
优点 缺点
可以准确定量；灵 放射性探 敏度高；本底低； 易于除去旧探针, 针 重新杂交新探针 对人体危害小；稳 非放射性 定，可供长时间内 持续使用；检测过 探针 程快；可同时进行 不同标记探针的杂 交；本底较低
短半衰期的探针需临用 前制备；放射性递减使 探针降解；放射性物质 对人体有害；费用贵 灵敏度不如放射性探针； 杂交条件受报告基团的 限制；重新杂交新探针 比较困难
被抑制；
③ DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择， 如缺口平移法、随机引物法、PCR标记法等，能用于 放射性核素和非放射性物质标记。
2.RNA探针
• 优点：杂交效率高，稳定性高，非特异性 杂交较少，未杂交探针可用RNase 降解， 减少本底的干扰。 • 缺点：易降解，标记方法复杂 。
3.寡核苷酸探针 寡核苷酸探针一般由17～50个核苷酸组成。 优势：可以区分仅仅一个碱基差别的靶序列； 缺陷：寡核苷酸不如长的杂化核酸分子稳定， 需优化杂交和洗脱条件以保证寡核苷酸探针
（三）Northern印迹杂交
Northern 印迹（Northern blot） 杂交是应用DNA探针检测特异
mRNA的另一种膜上印迹技术。
此项技术的原理和过程与 Southern印迹基本相同，只是检 测的分子是RNA，可用来对组织 或细胞中的mRNA进行定性或定 量分析。
Northern杂交应用
G-C含量越多 A-T含量越多 Tm值越高 Tm值越低
（2）溶液的离子强度
低离子强度 高离子强度 Tm值越低 Tm值越高
（3）pH值
pH值5-9 pH<4, pH>11 Tm值变化不明显 不利于氢键形成
（4）变性剂
干扰碱基堆积力和氢键的形成
3.复性 变性DNA经过一定处理重新形成双螺旋的过程。 影响复性速度的因素： DNA浓度 DNA片段的大小
第一节
核酸分子杂交的概念
变性
退火
复性
核酸分子杂交的基本原理
1、变性（denaturation）
定义：在一定的条件下，双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，
形成无规则线团，双链解链成为单链。
2、融解温度 (Melting Temperature, Tm)
定义：在DNA热变性时，其A260的升高达最大值一半时的温度。 影响Tm的因素： （1）DNA碱基的组成
DNA片段复杂性
合适的复性温度 适当的离子强度
重点提示
分子杂交：指具有一定同源序列的
两条核酸单链（DNA或RNA），在 一定条件下按碱基互补配对原则经 过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序 列的单链核酸片段作为探针，去查 找各种不同来源的基因组DNA分子
中的同源基因或同源序列。
2．荧光检测
• 荧光素：一类能在激发光作用下发射出荧光的物质 • 荧光显微镜观察、免疫组织化学法
3．化学发光底物
• 化学发光是指化学反应中释放的能量以光的形式 发射出来形成检测信号。 • 化学发光酶免疫技术中目前常用的酶有碱性磷酸 酶及辣根过氧化物酶 • 发射光线的强度反映了酶的活性，反应了杂化分 子的量。