第5节 单倍体植物

第5节单倍体植物培养

1单倍体概念

单倍体生物是指细胞中仅含配子染色体的个体。单倍体植物比单倍体动物多见。 在自然界中偶尔也能见到天然诱发的单倍体植株。它们通常经以下途径发育而成：

(1)孤雌繁殖途径体植株。植物卵细胞不经受精而发育成单倍体胚，继而长成单倍

(2)孤雄繁殖途径精子进入胚囊后不与卵细胞受精而独自发育成单倍体胚，再发育成株，卵细胞退化消失。

(3)无融合生殖精卵结合后，不仅受精卵发育，由于某种原因，助细胞或反足细胞也与受精卵形成的二倍体胚同步发育成单倍体胚，形成双胚或多胚种子。

主要手段：刺激子房单性结实、花药和花粉培养

1.1单倍体植物三个明显的特点：

体细胞染色体数减半；生长发育弱，体形小、各器官明显减小；雌雄配子严重败育，有的甚至不能进入有性世代。

1.2单倍体的应用潜力（意义）：

①迅速获得纯合型材料，缩短育种年限；②获得育种中间材料；③与诱变育种相结合可以提高诱变频率；④与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义；⑤作为遗传工程受体更为有效（当代表达）；⑥用作基础遗传研究的各个领域 1.3加倍后的二倍体特点：

属于真正的纯系。和常规多代自交纯化方法相比，可节省大量的时间和劳力。

2花药培养

2.1概念：

花药培养是把花粉发育到一定阶段的花药接种到培养基上，来改变花粉的发育程序，使其分裂形成细胞团，进而分化成胚状体，产生再生植株，或形成愈伤组织，由愈伤组织再分化成植株。属器官培养还是细胞培养？（提问）

花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。由于花粉已是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株。

优点：不受花药的药隔，药壁、花丝等体细胞的干扰；

缺点：较花粉培养难度大。属器官培养还是细胞培养？为何更多的要花药培养?(药壁提供营养) （提问）

共同的目的：花粉细胞→单倍体(haploid)细胞→单倍体植株（但不是最终目的但具应用潜力，为什么？）→经染色体加倍→正常结实二倍体植株。

2.2花药培养的基本程序是：

外植体选择－外植体(花蕾)预处理—外植体消毒—剥取花药—接种—诱导培养—分化培养—移栽

（1）花药材料的选择

关键选取处于合适发育期的花药，离体培养后才能启动花粉发育。实践表明，从减数分裂期至双核期的花药，均有可能诱导离体孤雄发育。

大多数园艺植物的花药培养，成功率最高的时期为单核靠边期。

四分体—小孢子—单核花粉—双核花粉

最适期

涉及到具体的植物，花药培养的取材时期并不绝对相同，如番茄以减数分裂期的幼嫩花药为好，而云苔属植物的某些材料则以花粉成熟时的花药为好。

（2）外植体(花蕾)预处理：

花药培养前给予一定的低温处理是十分必要的。

烟草、茄子3～5℃72小时水稻10℃10～14天

柑橘3℃5～10天马铃薯4℃48小时

低温处理的作用：可以激发花粉母细胞产生两个相等核:一个营养核一个生殖核；保持高比例的强生活力花粉，同时延缓体细胞组织的衰老；激发花粉产生原胚；促使细胞同步分裂。

（3）消毒接种培养

由于花药消毒比较简便，所以应从健壮无病植株中采集花蕾，因为未开放的花蕾中的花药为花被包裹，本身处于无菌状态，可仅用70％酒精棉球将花的表面擦洗即可。也可按对其他器官消毒处理方法进行，先用70％的酒精浸一下后，在饱和漂白粉溶液中浸10~20min，或用0．1％升汞液消毒7~lOmin，然后用无菌水洗3~5次。 （4）培养基的选择

基本培养基可用MS、B5、N6等；

⑸培养条件

温度：23－28℃；

光强：2000～4000ｌｘ；（书上5000~1000LX）

光照时间：16ｈ左右。

花药因子：此外，培养条件是一个值得注意的问题。由于花药中含有至今成分不明的水溶性“花药因子”，只有当培养基中的“花药因子”积蓄到一定程度，添加外源激素才会奏效。

3花粉及小孢子培养

3.1花粉培养的基本程序：

取材时期的确定→外植体(花蕾)预处理→外植体消毒→花粉或小孢子的分离→接种→培养

3.2取材时期的确定

四分体→单核早期→单核晚期→双核早期→双核晚期→三核期

预处理有利于改变正常的发育途径，而且还可以促进花粉植株的形成

3.3花粉或小孢子的分离:

花药→小烧杯(有基本培养基)→挤压花药(注射器内管) 花粉释放→过滤(尼龙筛)→低速离心（100-160r/min)→吸管吸掉碎片→加入新鲜培养基→连续进行两次过滤，到每毫升含103-104个花粉/mL（即花粉悬浮培养液）

3.4培养方法

花药看护培养，花粉悬浮培养（微室培养）

看护培养法：无菌条件下，将花药接种在固体培养基上→花药上面盖一层圆形滤纸→吸取1滴每毫升含10粒花粉粒的悬浮液接种在瓶内滤纸中央→形成胚状体→分化为单倍体植株。

药壁向花粉提供营养物质；通过药壁吸收、贮存和转化培养基中的外源物质第6节合子胚培养

1胚培养概述

定义：植物胚胎培养是胚及胚器官（如子房、•胚珠）在离体无菌条件下，使胚发育成幼苗的技术。•包括幼胚培养、成熟胚培养、胚珠培养、子房培养、胚乳培养等。

培养对象胚胎发生过程中的不同发育时期的胚和具胚的器官。如：成熟胚、幼胚、胚珠培养、子房培养。

1.1胚胎培养的意义

⑴克服远缘杂种的不育性在高等植物的种间和属间胚败育，•胚发育不全而不能正常萌发，因而得不到杂种种子，用胚胎培养和试管受精技术就可以解决这些问题。

⑵使胚发育不全的植物获得后代如兰花、天麻的种子成熟时，胚只有6～7个细胞，多数胚不能成活。如在种子接近成熟时，把胚分离出来进行培养，就能生长发育成正常植物。

⑶缩短育种年限在杂交育种中，•应用胚培养技术可以缩短育种周期1～2年。2胚培养类型

离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，•一般可分为成熟胚和幼胚培养。

（1）成熟胚培养

成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。由于种子外部有较厚的种皮包裹，不易造成损伤，易于进行消毒，因此，将成熟或未成熟种子用70%酒精进行几秒种的表面消毒，再用无菌水冲洗3-4次，然后在无菌条件下进行解剖，取出胚并接种在适当的培养基上培养。

（2）幼胚培养幼胚是指子叶期以前的幼小胚，由于幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值，因此，其研究和应用越来越深入和广泛。随着组织培养技术的不断完善，幼胚培养技术也在进步，现在可使心形期胚或更早期的长度仅0.1-0.2mm 的胚生长发育成植株。现在幼胚培养成功的有大麦、甘蔗、甜菜、胡萝卜等。

2胚培养方法

离体胚培养包括胚胎发生过程中不同发育期的胚，•一般可分为成熟胚和幼胚培养。（1）成熟胚的培养

健壮优良的个体自交种或杂交种子，常规消毒灭菌，剥离胚

培养基：大量元素和微量的无机盐为基本成分

附加成分：谷氨酰胺作为氮源，可以促进胚生长