酵母表达系统

甲醇酵母表达系统
甲醇酵母基因表达系统是一种最近发展迅速的外源蛋白质生产系统。

甲醇酵母是可利用甲醇作为唯一碳源的酵母，主要有H.Polymorpha、Candida Bodinii、Pichia Pastoris三种，其中Pichia Pastoris作为基因表达系统使用得最多、最广泛［1］。

与以往的基因表达系统相比，它具有无可匹敌的高表达特性，已被认为是最具有发展前景的生产蛋白质的工具之一。

编辑本段外源蛋白质的基因在甲醇酵母中的高效表达
目前已有多种蛋白质的基因在该表达系统中克隆成功，包括蛋白酶、酶抑制剂、受体、单链抗体等(表1)。

尽管各种外源蛋白质产生的水平不一，但各种蛋白质在甲醇酵母中的产生水平均为在细菌、昆虫或哺乳动物等表达系统中产量的10～100倍［2］。

如表皮生长因子(EGF)在酿酒酵母中的产量为7.4mg/L，而在甲醇酵母中为450mg/L，提高了60倍［3］。

椐报道，外源蛋白质在甲醇酵母中的产量最高可达12g/L［9］。

编辑本段实现外源蛋白质高效产生的关键因素
表达载体
首先，甲醇酵母中没有稳定的质粒，所以其表达载体采用整合型质粒。

利用醇氧化酶(甲醇代谢的关键酶)基因-1(AOX1)的启动子(PAOX1)和转录终止子(3′AOX1)构建成整合型表达载体。

PAOX1是一个极强的启动子，醇氧化酶的产量最高可占甲醇酵母中可溶性蛋白质的30%［2］，所以能使外源蛋白质在它的控制下高效产生。

其次，在载体中加入酿酒酵母的分泌信号和前导肽序列(α因子)构建分泌型载体，一方面可以减轻宿主细胞的代谢负荷，另一方面可以减少宿主细胞蛋白水解酶对外源蛋白质的降解，pPIC9K、pMETαA、B、C均为此类载体。

此外，使多拷贝目的基因整合入甲醇酵母染色体，形成多个表达单元，产生高产的菌株，此类载体有pAO815、pPIC3.5、pPIC9等。

受体菌
在以葡萄糖或甘油为碳源的培养基上生长时，甲醇酵母中AOX1基因的表达受到抑制，而在以甲醇为唯一碳源时，诱导基因表达，使外源蛋白质的产量更高。

甲醇酵母适合高密度连续培养的条件，细胞干重达100g/L以上，蛋白质产量极高［14］。

受体菌采用蛋白水解酶缺陷型，从而大大降低产物的降解。

常用的甲醇酵母受体菌有GS115、KM71、PMAD11、PMAD16等。

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编辑本段应用前景
经过近几年的发展完善，甲醇酵母表达系统已日趋成熟，应用也日趋广泛。

国内已有多篇在甲醇酵母中生产外源蛋白质成功的报道(表2)。

美国Invitrogen公司也已开发出多种新型的甲醇酵母表达系统试剂盒，如Multi-copy Pichia Expression Kit、Easyselect Pichia Expression Kit、Pichia methanolia Expression System等，利用甲醇酵母表达系统克隆一个外源基因已十分方便。

相信随着对甲醇酵母研究的进一步深入，它在生产外源蛋白质方面将日益展示出诱人的前景。