样品前处理技术基础理论

样品前处理技术基础理论
Waters Chemistry Operations
©2008 Waters Corporation
培训概要 培训概要
一
样品前处理的重要性及原则
二
样品前处理一般性步骤
三
样品前处理方法及比较
四
固相萃取技术
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一
样品前处理的重要性及原则
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1- 吸取 吸取200 µL血浆 血浆 2- 加入400-600 µl乙腈 加入 乙腈 3- 高速混合 4- 离心取上清液 5- 以水稀释后进样
固相萃取技术 (SPE)
先进的样品前处理方法
依据目标化合物在固定相和流动相间分配系数的不同将 其从液相提取至固定相中（ 本质上为色谱分离方法） 其从液相提取至固定相中（ 本质上为色谱分离方法）
可同时取得对样品的净化与富集效果， 可同时取得对样品的净化与富集效果，彻底去除干扰物并浓缩样品 分析结果呈高度可靠性 使得检测灵敏度和选择性大大提高 明显延长色谱柱寿命， 明显延长色谱柱寿命，减小系统维修的频度 样品制备快速、涉及人工少、 样品制备快速、涉及人工少、溶剂用量少 分析结果的精密度提高(偏差常 <5%) 分析结果的精密度提高 偏差常 多样化的产品设计迎合不同样品通量要求
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一
样品前处理的重要性及原则
二 样品前处理一般性步骤 三 样品前处理方法及比较 四
固相萃取技术
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样品处理一般性步骤
提取
净化
测定
根据样品类别 和被分析物的 结构、 结构、极性等 理化性质选择 合适的提取溶 剂
有机层
装置简单
水层
操作容易 常被认定为成本低廉 费时费力 常因乳化效益使相间分层不彻底， 常因乳化效益使相间分层不彻底，使得重复样的分析结果存在显 著偏差(常在 常在10%~20%之间 之间) 著偏差 常在 之间 若需萃取的样品体积大（如环境分析中），则可能消耗大量的有 若需萃取的样品体积大（如环境分析中），则可能消耗大量的有 ）， 机溶剂。由此可能在购买、储藏、处置溶剂时花费庞大*。 机溶剂。由此可能在购买、储藏、处置溶剂时花费庞大 。
被测物在样品 基质中
提取
分析
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样品预处理的目的
除去微粒 减少干扰杂质 浓缩微量的组份 提高检测的灵敏度及选择性 改善分离的效果 有利于色谱柱及仪器的保护 溶剂置换
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样品的预处理重要性
占样品分析时间的比例 —样品预处理所用时间远大于色谱分离的时间 占分析的消耗总成本最大 —消耗大量的溶剂及其他化学品 实验的重复性及准确性最差的环节 —影响实验结果好坏的最重要因素
离心 过滤 液-液萃取 液萃取 SPE SPME ……
GC GC-MS HPLC LC-MS CE
……
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一
样品前处理的重要性及原则
二 三
样品前处理方法及比较 样品前处理方法及比较
四
固相萃取技术
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样品预处理技术
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样品前处理原则
原则
①制备过程中避免组分发生化学变化； 制备过程中避免组分发生化学变化； ②要防止和避免欲测定组分的沾污； 要防止和避免欲测定组分的沾污； ③尽可能减少无关化合物引入制备过程； 尽可能减少无关化合物引入制备过程； ④尽可能简单易行。 尽可能简单易行。
是决定性的步骤
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常见样品前处理方法
常见样品前处理包括: 常见样品前处理包括:
固相萃取 稀释 沉淀
样品前处理
过滤 离心
液液萃取
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样品前处理的各种方法
方法 沉淀 液—液萃取 固相提取 渗析/超滤 电泳 蒸馏/蒸发
注: 大量储存、使用和处置溶剂可对操作者的长期健康产生负面影响 大量储存、 ，并可带来火灾隐患
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传统的样品前处理方式
蛋白质沉淀法 (PPT)
在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂， 在血清、血浆或尿样中加入有机溶剂，使 样品中的蛋白质沉淀， 样品中的蛋白质沉淀，然后经离心去除 简单快速 可被自动化， 可被自动化，适用于高通量分析 若检测限要求不高时较适用 的蛋白质， 属快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约 快速但粗糙的净化技术， 仅可去除约90-95%的蛋白质，而基 的净化技术 的蛋白质 质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除（ 质中的高盐份和其他内源性干扰物如磷脂等完全未被去除（此为 LC/MS分析时遭遇离子抑制的根源 ） 分析时遭遇离子抑制的根源!） 分析时遭遇离子抑制的根源 分析柱寿命较短， 分析柱寿命较短，LC/MS系统常需停机进行离子源清洗 系统常需停机进行离子源清洗 导致样品稀释 导致样品稀释, 不适合用于超痕量分析场合 样品稀释 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度(若无内标， 进样前可能需要进行溶剂蒸发以获得足够的灵敏度 若无内标，分 若无内标 析重现性不佳) 析重现性不佳
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HPLC与 分离效率比较 - HPLC与SPE
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Normalized concentration
0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20
1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 5 10 15 20
Elution volume (mL)
“Sep-Pak Cartridges” Sample Enrichment & Purification •非常成熟的技术 非常成熟的技术 •数千化合物的参考文献 数千化合物的参考文献
•0.01 to 1000 克 •多种规格 多种规格
•洗脱剂 洗脱剂 •废液 废液
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常见固相提取小柱的构造
柱体 色谱柱床 (吸附剂) 过滤膜/筛板
二
样品前处理一般性步骤
三
样品前处理方法及比较
四
固相萃取技术
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样品前处理的重要性
重要性
样品前处理在色谱分析过程中是一个既耗时又极易引 进误差的步骤， 进误差的步骤，样品处理的好坏直接影响色谱分析的最终 结果，因此，为了提高分析测定效率， 结果，因此，为了提高分析测定效率，改善和优化色谱分 析样品制备方法和技术是一个重要问题。 析样品制备方法和技术是一个重要问题。 由于食品样品属于复合基质体系,多含有蛋白、油脂 碳 由于食品样品属于复合基质体系 多含有蛋白、油脂,碳 多含有蛋白 水化合物、色素等成分,复杂的基质背景会对被分析目标 水化合物、色素等成分 复杂的基质背景会对被分析目标 化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦,因 化合物的提取、分离、净化和测定等带来很大的麻烦 因 此食品的样品前处理不仅复杂困难,而且对于分析结果的 此食品的样品前处理不仅复杂困难 而且对于分析结果的 准确可靠和灵敏具有决定性作用。 准确可靠和灵敏具有决定性作用。
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样品前处理的重要性及原则
二 三
样品前处理方法及比较 样品前处理一般性步骤
四
固相萃取技术
Байду номын сангаас
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概 念
固相提取（ 固相提取（Solid Phase Extraction，SPE)是一 ， 是一 种重要的样品前处理技术， 种重要的样品前处理技术，由液固萃取和柱液相色谱技术 相结合发展起来的。 相结合发展起来的。利用固相吸附剂将液体样品中的目标 化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离， 化合物吸附，与样品的基体和干扰化合物分离，然后再用 洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。 洗脱液洗脱，达到分离和和富集的目的。
固相提取技术
Solid Phase Extraction (SPE)
——液相与固相 两相 ——液相与固相
— 容易分离 — 多种吸附剂可供选择 o 反相－最常用！ o 正相 o 离子交换 o 具有高选择性的新型吸附剂 — 溶剂消耗少 —与液液提取相比 — 减少人力与时间 — 容易自动化
液相色谱基础
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应用领域
已被广泛的应用于：
化学、 化学、化工行业 制药行业 临床医学研究
食品安全领域
烟草行业 环境保护
中草药研究 ……
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固相提取技术
Solid Phase Extraction (SPE)
色谱填料颗粒填装小柱 1978年由 年由Waters首次推出商品化产品： 推出商品化产品： 年由
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SPE之区别 HPLC 与SPE之区别
HPLC
颗粒直径 柱床效率 柱外体积 柱长 塔板数 (N) ~5 µm high low 5-30 cm ~10,000
SPE
40-80 µm low high ~1 cm < 50
Bottom line: HPLC can separate similar compounds. SPE requires a significant selectivity difference between compounds for separation. Compounds not well resolved by HPLC cannot be separated by SPE with a similar retention mechanism.
梨的色谱分析：SPE的作用 梨的色谱分析：SPE的作用 不同提取过程的结果比较
乙腈提取 未净化
乙腈提取 用水稀释 Oasis® HLB 提取
乙腈提取 用水稀释 Oasis® HLB 提取 用Sep-Pak® 氨基小柱净化
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为何需要样品前处理? 为何需要样品前处理?
60%以上的工作和费用花费在样品前处理上 60%以上的工作和费用花费在样品前处理上 三个目的: 三个目的:
除去样品基质中的干扰物 富集组分 增强仪器的性能
对于LC/MS/MS高灵敏度的仪器, 适当的样品前处理对于减少基 高灵敏度的仪器, 对于 高灵敏度的仪器 质干扰和富集组分至关重要！ 质干扰和富集组分至关重要！
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为何需要样品前处理? 为何需要样品前处理?
Cablibration 9% Instrument 8% Integration 6% Sample Processing 30%
Chromatography 7% Sample Introduction 6% Contamination 4% Columns 11% Operator 19%
色谱分析的误差来源
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为何需要样品前处理? 为何需要样品前处理?
样品前处理所消耗时间
Collection Analysis 6% 6%
Data Management 27%
Sample Processing 61%
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原理及特点
利用杂质或目标化合物与样品基体溶剂和吸附剂之间 亲和力的相对大小差异实现净化分离。 亲和力的相对大小差异实现净化分离。与传统的液液萃取 相比具有明显的优势。 相比具有明显的优势。
更有效的是分析物与杂质分离 回收率、富集倍数高
特点
有毒溶剂用量少 两 相 分 离 操作简单、易自动化
选择性基础 溶解度 样品在两相中的分配 样品在吸附剂上的吸附与分配 分子量与体积 电荷/淌度 沸点与蒸气压
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传统的样品前处理方式
液液萃取 (LLE)
根据分析物在互不相溶的两相中的溶解度差 异来将分析物从一相提取至另一相中。 异来将分析物从一相提取至另一相中。