HBV-DNA检测标准操作程序

2.3 吸取已编号的待测血清或血浆样本、试剂盒中的阴性对照、强阳性对照、临界阳

性对照及定量标准品（1→）各200μl,分别加入到1.5ml离心管中，在离心管上编好号，振荡混匀。

2.4 56℃温浴15-2Omin,期间颠倒混匀数次。

2.5 加入200Ul无水乙醇，充分混匀，将全部液体转入装有2ml收集管的硅胶柱中，IoOoorPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。2.6 在硅胶柱中加入500Ul溶液Wl（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.7 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇），1000OrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液，将硅胶柱重新放入收集管中。

2.8 在硅胶柱中加入500Ul溶液W2（使用前先检查是否加入相应体积的无水乙醇）,IoOOOrPm离心Imin,倒掉收集管中的废液。

2.9 将硅胶柱放入收集管中，1200OrPm空管离心3min,丢弃收集管。

2.10 将硅胶柱放入新的1.5ml离心管中，开盖静置L2min,往硅胶柱中心加入80Ul 的TE洗脱液，静置2-5min,1200OrPm离心2min,丢弃硅胶柱，盖好离心管盖，做好相对应的编号。（注意：TE洗脱液的体积应不少于50ul,体积过小影响回收率。为增加基因组DNA的回收率，可将TE洗脱液稍微加热。获得的DNA应保存在-20°C,以防DNA降解。）

3 .加样（在样本处理区进行）

3.1 向设定的n个PCR反应管中分别加入步骤1处理好的样品DNA、强阳性对照、临界阳性对照、阴性对照以及定量标准品（4个）各20μ∣,盖紧管盖，稍做离心。

3.2 将PCR反应管转移到检测区，放入相应的荧光PCR检测仪内，记录样品摆放顺序。

4 .PCR扩增（检测区）

4.1 循环条件设置

使用ABI7500和Line-Gene9660荧光PCR检测仪时循环程序设置如下：

1150℃2min无

2195℃9min无

34595℃15sec无

58℃50sec单次采集荧光4138℃10sec无

■阴性对照无定量值出现，且内标Ct值W40；

■强阳性对照检测值范围(3.16X105-3.16X106),临界阳性对照检测值范围(3.16×101-3.16×102),且内标Ct值W40。

否则试验视为无效；

5.2.2 将定量标准品1-4的浓度输入，PCR仪将自动以定量标准品浓度的对数值为横坐标，并以其实际测得的Ct值为纵坐标绘制出标准曲线，其中标准曲线相关系数R

的绝对数应大于或等于0.980,否则视定量结果无效。

6 .定量结果解释

6.1 检测样本中40IU∕ml≤HBVDNA≤4.0X108IU∕ml,测定结果有效，可直接报告相应的读

数；

6.2 检测样本中HBVDNA>4.0X108l∪∕ml,既可直接报告为>4.0X108IU∕ml,也可以对样本血清或DNA进行IOO倍浓度梯度稀释，测定结果应以稀释倍数进行校正；

6.3 检测样本中20IU∕ml≤HBVDNA≤40IU∕ml时;且内标Ct值≤40时，表明病毒载量低，测定值仅供参考；

6.4 检测样本HBVDNAV20IU∕ml,且内标Ct值≤40时，表明病毒载量低，报告为小于最低

检出限；

6.5 检测样本Ct值显示45或Unde3且内标Ct值W40时，报告为小于最低检出限。

7 .检验方法的局限性

7.1 该试验方法仅适用于具有FAM和HEX/JOE荧光通道的荧光定量PCR分析仪;

7.2 本试剂盒所检测的靶基因是相对高保守片段,但由于HBVDNA存在变异的可能，仍无法避免漏检可能。因此建议本试剂盒实验结果应与其它临床数据结合起来解释。

8 .产品性能指标

8.1 特异性：检测国家标准品，对8份阴性参考品的检测结果均是阴性。

8.2 敏感性：检测国家标准品，对9份阳性参考品的检测结果均是阳性。

8.3 灵敏度：检测国家线性参考品L0~L5,标准曲线相关系数R的绝对数应大于或等于0.980o

8.4 精密性：测定企业精密性参考品10次，检测浓度对数值的变异系数CV(%)应不高于5%o

8.5 最低检出量:20l∪∕mL

8.6 定量检测线性范围：40-4×108l∪∕m∣o

8.7 检测范围覆盖较为常见的B、C、D基因型及较少分布的A、E、F、G、H基因型。

8.8 检测200例临床HBV阴性样本均为阴性，符合率IO0%；与HIV、HCV>梅毒均无交叉反应。

8.9 样品中甘油三脂、胆红素、IgG水平升高对本检测的HBVDNA定量没有干扰。样品中血红蛋白水平升高到20Omg∕dL对检测结果没有干扰。

8.10 使用干扰素a・2a、拉米夫定、阿德福伟脂、恩替卡韦、替比夫定治疗药物的病人样品对HBV定量结果没有干扰。

8.11 临床研究中，对比试剂为“乙型肝炎病毒核酸定量检测试剂盒(PCR.荧光探针法)”，与对比试剂检测的总一致率为97.5%,阳性一致率为98.7%,阴性一致率为84.0%o与对比试剂浓度测定Pearson相关系数为rp=0.974(95%CI:0.969〜0.978,P<0.001)；两者KaPPa系数为0.827(95%CI:0.744〜0.910,P<0.001)oBland-Altman 分析，其一致性界限(LimitofAgreement,LoA)为[-0.977,0.824],95.7%的点落入此区间；两测量值拟合的线性回归方程为Y=O.058+0.973X(R2=0.948),回归方程成立(P<0.001),截距及斜率的95%CI分别为10.039,0.155]>[0.954,0.991]o

此标准操作变更程序：如果本操作程序使用者在实际工作中发现其存在问题，则应向科室负责人提出，科室负责人则召集所有与本程序有关的人员讨论，以决定是否需要变更本程序。