蛋白抽提Protocol(全)lLoading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol

Loading Buffer煮细胞抽提总蛋白Protocol
1.细胞计数（约1×106的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；
2.预冷1×PBS 500ul重悬洗一次，转至500ul EP管（2000rpm×5min）；
3.去上清，后甩一次，将上清去尽；
4.按每1×106的细胞加50ul loading buffer 加入2×loading；
5.V ortex一下，煮10～15min一次×2～3次直至无粘丝；
6.每次煮好将其放于冰上，静置约2min，V ortex一下，再甩一下；
7.三次后用枪吸起，如没有粘丝，即可；
8.每次上样约5ul（50ug/ul蛋白）
RIPA裂解抽提总蛋白Protocol
1.细胞计数（约1×107的细胞），离心收集细胞（2000rpm×5min）；
2.预冷1×PBS 1ml重悬洗2次，转至1.5ml EP管（2000rpm×5min）；
3.去上清，后甩一次，将上清去尽；
4.按照如下比例加入裂解试剂：
RIPA：300ul/1×107细胞
PMSF：3ul(1:100)
Cocktail ：0.3ul(1:1000)
5.吹打均匀，冰上放置30-40min，中间每10分钟V ortex一次；
6.4℃预冷离心：10000rpm ×10min；
7.收集上清，转移至已预冷新EP管，即为总蛋白。

【为了浓缩蛋白，加RIPA的量改为200ul或者更低，可稍微延长冰上裂解时间，而RIPA（1）＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）的比例不变】
核，浆蛋白抽提Protocol
一.收核-浆蛋白
收浆蛋白
1.细胞计数（约1.5×107的细胞），离心收集细胞（1100rpm×5min）；
2.用4℃预冷的PBS重悬，转至1.5mL的EP管中，离心（4000rpm×5min，4℃）；
3.去上清，加入A Buffer1mL/1×107 cell，重悬，4℃放置10min，离心（2500rpm
×3min，4℃）；
4.去上清，加入A’Buffer250uL/1.5×107cell，重悬，4℃放置3min，离心
（5000rpm×1min，4℃），吸取上清（上清是浆蛋白）；
收核蛋白
5.再用A’ Buffer 500uL/1.5×107 cell，重悬，4℃放置3min，离心（5000rpm×
1min，4℃），吸走上清，12000rpm×30sec，把上清完全吸干净；
6.剩余沉淀中加入B’Buffer (或者RAPI)50uL，重悬（振荡），4℃放置40min
（每隔10min振荡一次）；
7.离心（12000×10min，4℃），取上清即为核蛋白，－80℃保存。

2
Buffer A’的配制：
Buffer A’(2ml) = 1960ul Buffer A + 40uL 10%NP-40 + 20uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin Buffer A’(1ml) = 980ul Buffer A + 20uL 10%NP-40 + 10uL 10mg/mLPMSF + 1uL Aprotinin （Aprotinin可以用cocktail代替,而且只要核蛋白的时候可以不加）
2
Buffer B’的配制：
Buffer B’ = 1mL Buffer B + 10uL 10mg/mLPMSF + 0.5uL Aprotinin(可以用cockltail代替)
核基质蛋白抽提Protocol
1、细胞计数（约1×107的细胞），离心（1100rpm×5min）收集细胞；
2、用4℃预冷的PBS重悬，将细胞移至1.5ml EP管中，1×PBS洗一遍；
3、加300ul RIPA/1×107的细胞，裂解细胞，至冰上15-30min；
RIPA＋PMSF（1：100）＋Cocktail（1：1000）
4、4℃预冷离心：13000rpm ×10-15min；
5、将离心后的上清转移至新的已4℃预冷的1.5ml EP管，冰上备用(总蛋白)；
6、用１×PBS洗管底的pellet×2遍；
7、加入Urea-Lysis buffer 10-15ul裂解pellets，vortex 10min；
8、4℃预冷离心：13000rpm ×10min；用BufferA 90ul稀释，此为核基质蛋白。

RIPA（PH 8.0）：
150mM NaCL
1% NP-40
0.5% DOC
0.1% SDS
50mM Tris
Urea-Lysis buffer（PH 8.0）：
100mM NaH2PO4
10mM Tris-HCL
300mM NaCL
8M urea
Buffer A：
100mM NaH2PO4
10mM Tris-HCL
300mM NaCL
1% Triton X-100
cytoplasmic cell fractions were prepared by incubating the cells in icecold
Iso-Hi buffer
140 mM NaCl
25 mM Tris [pH 7.4]
1.5 mM MgCl2)
0.5% Nonidet P-40
for 5 min and then subjecting them to low-speed centrifugation to collect the nuclei. Nuclei were incubated in
high-salt extraction buffer
20 mM HEPES (pH 7.9)
25% (v/v) glycerol
0.5 MNaCl
1.5 mM MgCl2
0.2 mM EDTA
0.5 mM phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)
0.5 mM DTT;
for 1 h at 4C. The DNA-particulate fraction was pelleted by microcentrifugation (15,000 rpm), washed once in high-salt buffer, solubilized in radioimmunoprecipitation assay buffer(RIPA), and sonicated to sheer the DNA. Equal amounts of all fractions were precipitated with trichloroacetic acid, resuspended in protein sample buffer, and separated on a sodium dodecyl sulfate (SDS)–10% polyacrylamide gel.。