GST融合蛋白柱上酶切

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GST融合蛋白柱上酶切

1. 试剂准备

缓冲液A（平衡缓冲液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，调节pH 值至8.0

缓冲液B（洗脱缓冲液）：10mM Glutathione（还原型），50mM Tris-HCl，调节pH值至8.0。因Glutathione 易氧化，需现用现配

2. 层析柱准备

2.1. 用去离子水冲洗层析柱底筛板与接头，确保柱底筛板上无气泡，关闭柱底出口，并在柱底部留出1-2cm 的去离子水

2.2. 将GST亲和树脂悬浮，取2ml加入层析柱中，连接上恒流泵

2.3. 用5倍柱体积的缓冲液A进行平衡，使填料处于与目的蛋白相同的缓冲体系下，起到保护蛋白的作用

3.柱上酶切

3.1. 裂解菌体，充分离心后收集上清

3.2. 取上清加入层析柱，置于旋转培养器上，室温孵育1h，收集流出液，留样待检

3.4. 用5倍柱体积的缓冲液A进行清洗，去除非特异性吸附的杂蛋白，收集洗杂液，留样待检

3.5. 向层析柱中添加适量3C酶，并添加适量体积的缓冲液A，室温下进行柱上酶切~3h

3.6. 分别收集流穿和3倍柱体积缓冲液B清洗的洗脱产物，SDS-PAGE分析结果

3.7. 取上一步骤得到的流穿于新的GST亲和树脂再次进行GST亲和层析，收集流穿，即为酶切后的目的蛋白组分

3.8. 将纯化过程中得到的样品（包括流出组分、洗杂组分和洗脱组分等）以及原始样品使用

SDS-PAGE 检测纯化及酶切效果

详细步骤可参照GST亲和层析介质使用说明书