优化流式细胞术测定保存血小板CD62p表达

在血小板多种表面分子活化标志物中 ,活化和 非活化血小板之间的差别以 CD62p 最大[1 ] ,区分最 明显 ,其它血小板激活标志物在活化和非活化血小 板之间重叠较多 ,难以确定其表达率 。利用 CD62p 表达测定活化血小板具有明显的优越之处 。患者外 周血血小板 CD62p 阳性率的测定在血栓性疾病及 广泛性血管内炎症等疾病发展及其监测中有较高的 价值[2 ] 。
信息获得和存储 以 SSC , FSC 和 CD61 联合 识别获取血小板 。以 300 个/ 秒的速度获取 5 000 10 000 个血小板 ( 图 1 中 R1 或图 2 中 R2) ,对其 FSC ,SSC ,FL2 和 FL3 信息进行储存 。
Figure 1 The events were discriminated by their for ward scat2 ter( FSC) and side scatter( SSC) in R1
L Quest 3. 1 支持 , 激发光采用 488 nm 的激光 , 用 Flow2Set beads (Becton Dickinson) 对散射光和荧光 参数进行校正 ,或用单纯血小板对照和各种单染 (抗 CD62p RPE 单染和抗 CD61 PerCP 单染) 对照校正 荧光 FL2 ( CD62p RPE) 和 FL3CD61 PerCP 补偿后 待用 。
基金项目 :本课题为国家自然科学基金资助项目 编号 39970812 通讯作者 :欧阳锡林 电话 : (010) 66937134. E2mail : ouyang70 @ plagh. com. cn.
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Modif iewenku.baidu.com Flo w Cytometry Assay f or CD62p Expression of Preserved Platelets
OU YAN G Xi2Lin , L IU Jing2Han , SHI Qun , GAO Da2Yong1 ,2
( Depart ment of B lood T ransf usion , General Hospital of PL A , Center of Cli nical T ransf usion of PL A , Beiji ng 100853 , Chi na ; 1 I nstit ute of Cryobiomedici ne , Faculty of Therm al Science and Energy Engi neeri ng , U niversity of Sciences and Technologies of Chi na , Hef ei 230027 , Chi na ; 2 Depart ment of Mechanical Engi neeri ng , U niversity of Kent ucky , L exi ngton , K Y 40506 - 0108 US A )
Abstract CD62p expression was an important monitoring parameter for preserved platelets quality. To set up an optimized flow cytometry assay for preserved platelets based on t he CD62p expression on platelets , t he platelet samples were collected , 0. 1 mmol/ L persantine and 1. 1 mmol/ L ED TA were added into t he modified TBS used to replace PBS dilution ; t he met hodological evaluation were carried out . Results showed t hat 0. 1 mmol/ L persantine and 1. 1 mmol/ L ED TA achieved to prevent platelets activation during t he test procedure. The favorable negative or positive samples were prepared for check of fluorescence antibody′s quality to ensure t he validity of results. CD61 was used to identify platelets for assay and improve veracity of assay. The special injector was also replaced by special big syringe needle for blood collection to reduce in vit ro artifacts , and t he prepared sample can be steady2going for 48 hours at 4 ℃after fixed by 1 % paraformaldehyde. It is concluded t hat t his flow cytometry assay for CD62p positive platelets is simple and efficient . Key words flow cytometry ; platelet preservation ; CD62p expression
血液采集与血小板制备 室温 (22 ℃左右) 条件 下 ,用 ACD 四联采血袋于 3 分钟内采集健康献血者 全血 200 ml , 用于制备富含血小板血浆 ( FPRP) , COB E Spectra 血细胞分离机单采集健康献血者浓 缩血小板 200 ml 。
血小板 CD62p 的表达测定方法 标本处理方法 将血小板标本用 25 ℃ TBS 调 节浓度至 (200 - 400) ×109/ L ,潘生丁终浓度为 100 μmol/ L ;在 FCM 专 用 试 管 中 加 入 抗 CD61 和 抗 CD62p 各 5μl , TBS 30μl ,4 ℃避光保存待用 ;然后加 入相应的血小板 5 μl ,轻轻混匀后室温避光孵育 15 分钟 ;加 4 ℃1 %多聚甲醛 500 μl ,避光固定 15 - 30 分钟 ;48 小时内进行 FCM 分析 。 对照包括 单纯血小板对照 ;抗 CD61 PerCP 单 染 ;抗 CD62p RPE 单染 ,用于校正流式细胞仪 SSC , FSC 和相应频道的荧光参数 。 流式细胞术结果分析方法 仪 器 校 正 FACSCalibur 流 式 细 胞 仪 由 CEL 2
优化流式细胞术测定保存血小板 CD62 p 表达
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材料与方法
材料 主要 仪 器 离 心 机 : 德 国 Heraeus Cryof uge 8000 。血细胞计数仪 : M E K26180 K 型日本 N IHON KO HD EN 公司 。FACSCalibur 流式细胞仪 (Becton Dickinson) 和 CELL Quest 分析软件 。 主要试剂 抗 CD61 : PerCP 标记 (Becton Dic2 kinson) 。抗 CD62 : RPE 标记 ( PharMingen) 。改良
Kent ucky , Lexington , KY 40506 - 0108 U SA)
摘要 CD62p 阳性率是保存血小板质量监测的重要指标之一 。为在静脉全血内血小板 CD62p 测定方法的基础 上优化建立流式细胞术 ( FCM) 测定保存血小板表达 CD62p 的方法 ,在血小板检测标本内加入 0. 1 mmol/ L 潘生丁 稳定血小板 ;对 TBS 溶液进行了改良 ,添加了 1. 1 mmol/ L 的 ED TA 和 100μmol/ L 潘生丁 ,用以代替 PBS ;采用新 鲜富含血小板血浆 ( FPRP) 制备的阴 、阳性对照 ; 进行方法学评价 。结果表明 : 加入 0. 1 mmol/ L 潘生丁和 1. 1 mmol/ L 的 ED TA 可以有效防止实验过程中的血小板人为激活 ;采用新鲜富含血小板血浆 ( FPRP) 制备的阴 、阳性 对照既可优化 FCM 分析方法 ,还可用于检验所购荧光抗体的质量 ,保证实验结果的有效性 。采用泛血小板特异性 标志物 CD61 可灵敏特异地识别血小板 ,提高了实验抗干扰能力 。制备保存血小板时采用的是专用大号采血针 ,抽 血流畅 ,对血小板 CD62p 表达测定人为影响很小 ,明显优于用注射器采集患者静脉全血的做法 。CD62p 测定灵敏 度可达 1 % ,制备的标本可稳定 48 小时 。结论 :利用该流式细胞术可以灵敏而特异地测定保存血小板的 CD62P 表 达率 ;该方法简便易行 ,提高了结果的准确性 ,具有良好的稳定性和重复性 。 关键词 流式细胞术 ; 血小板保存 ; CD62p 中图分类号 R2331. 143 ; R457. 1
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中国实验血液学杂志 Journal of Ex peri mental Hem atology 2002 ; 10 (5) :462 - 465
优化流式细胞术测定保存血小板 CD62p 表达
欧阳锡林 ,刘景汉 ,石 群 ,高大勇1 ,2
(解放军总医院输血科 ,解放军临床输血中心 ,北京 100853 ;1 中国科技大学热科学及能源工程系 低温生物医学研究所 ,合肥 230027 ; 2Depart ment of Mechanical Engineering , U niversity of
TBS : (NaCl 137 mmol/ L ; KCl 2. 8 mmol/ L ; MgCl2
1 mmol/ L ; NaHCO3 12 mmol/ L ; HEPES 10 mmol/ L ;
Na H2 PO4 0. 4 mmol/ L ; D2glucose 5. 5 mmol/ L ; ED TA 1. 1 mmol/ L p H 7. 4) ,用前 25 ℃水浴 15 分 钟 。多聚甲醛溶液 :含 1 %多聚甲醛的等渗 p H 7. 4 PBS(4 ℃保存 1 周) 。人凝血酶 : 10 U/ L ( Sigma) 。 Gly2Pro2Arg2Pro 乙 酸 盐 ( GPRP ) : 25 mmol/ L ( Sigma) 。潘生丁 :100 mmol/ L (避光保存)
近年来 ,血小板 CD62p 阳性率的测定作为保存 血小板质量监测指标之一 ,也逐步受到重视[3 ] 。国
内尚未见体外保存血小板 CD62p 阳性率的测定方 法的报道 。本研究在文献报告的测定静脉全血中血 小板 CD62p 表达的方法基础上 ,建立了适合于测定 保存血小板 CD62p 表达的流式细胞术 ,并对测定保 存血小板 CD62p 表达率的方法进行优化及评价 ,为 血小板保存技术研究建立方法基础 。
Figure 2 The events were gated from R1 and discriminated by SSC and CD61 positive in R2
Figure 3 , Figure 4 and Figure 5 The CD62p histogram of negative control( f igure 3) , positive control( f igure 4) and their overlay ( f igure 5) when ACD2WB was selected