western blot,WB,蛋白质印迹法,免疫印迹试验

Western Blot步骤
Western Bolt基本步骤
组织细胞裂解提蛋白→蛋白定量→配试剂→配胶→上样→电泳→电转→封闭→敷一抗→洗→敷二抗→洗→显影
一、组织细胞裂解提蛋白
1. 把组织剪切成细小的碎片。

2. 融解RIPA裂解液，混匀。

取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使RIPA与PMSF的比例为100:1（现在EP管里配好再分别加）。

3. 按照每20毫克组织加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。

(如果裂解不充分可以适
当添加更多的裂解液，如果需要高浓度的蛋白样品，可以适当减少裂解液的用量。

)
4. 用玻璃匀浆器匀浆，直至充分裂解。

5. 充分裂解后，14000g，4℃，离心15分钟，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和
免疫沉淀等操作。

6. 以上步骤确保于冰上进行，特别是匀浆时。

7. 如果组织样品本身非常细小，可以适当剪切后直接加入裂解液裂解，通过强烈vortex使
样品裂解充分。

然后同样离心取上清，用于后续实验。

直接裂解的优点是比较方便，不必使用匀浆器，缺点是不如使用匀浆器那样裂解得比较充分。

二.蛋白定量
配液（按照BCA蛋白浓度测定试剂盒说明书进行）
1、蛋白标准品的准备
a.取0.8ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准(20mg BSA)中，充分溶解后配制成25mg/ml
的蛋白标准溶液。

配制后可立即使用，也可以-20ºC长期保存。

b.取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml（50倍）。

例如取20μl 25mg/ml蛋
白标准，加入980μl稀释液即可配制成0.5mg/ml蛋白标准。

蛋白样品在什么溶液中，标准品也宜用什么溶液稀释。

但是为了简便起见，也可以用0.9% NaCl或PBS稀释标准品。

稀释后的0.5mg/ml蛋白标准可以-20ºC长期保存。

2.BCA工作液配制根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。

例如5ml BCA试剂A加100μl BCA试剂B，混匀，配制成5.1ml BCA 工作液。

BCA工作液室温24小时内稳定。

（需根据以下加样量计算所需工作液量，尽量算多点。

标准物8孔，检测物X个，每孔需200ul，所以共需工作液（8+X+2）×200ul。

）加样
1．加标准品于96孔板，依次加0，1，2，4，8，12，16，20ul形成梯度，随后每孔中加入PBS使最后每孔总量为20ul。

如下
蛋白定量标准品ul 0 1 2 4 8 12 16 20 PBS ul 20 19 18 16 12 8 4 0 蛋白定量工作液ul 200 200 200 200 200 200 200 200
2. .（另排）再96孔板中加入10ul总蛋白，每孔加入10ulPBS，再每孔加入工作液200ul。

如下
总蛋白ul 1 1 1 1 1 1
PBS 19 19 19 19 19 19
工作液200 200 200 200 200 200
全部吹打混匀（不要产生气泡）后放入水浴（37℃30min）或60℃温箱30min，根据蛋白浓度决定，浓度越高需要的温度越高时间越长
5.在电脑中用酶标仪（选取吸光度为562nm）读出OD值，并用Excel作图分析。

在公式那边选择散点图（R2大于或等于0.99才能使用）
输入OD值后先计算出标准曲线，得到公式后计算出样品浓度，所计算得到的浓度乘以稀释倍数（此处乘以20，因为加入19ulPBS即稀释了20倍，故乘以20）。

再计算出上样体积。

如上样量为50ug，浓度为2.84384，则最后所加体积为50÷2.84384。

上样体积计算具体步骤（如上图）
1.首先将在酶标仪中得到的OD值，输入Excel表格中。

2.将浓度梯度OD值单独列出，并在其下方一行分别输入0,0.025,0.05,0.1,0.2,0.3,0.4,0.5.选定两行后绘制浓度梯度曲线（插入→插入散点图→点选图表上的点后右键→添加趋势线→点选趋势线后右键→设置趋势线格式→选择“显示公式”及“显示R平方值”）
3.R平方值需大于0.99公式才可使用，若R平方值需小于0.99，则需踢除趋势线上较偏离的点，直至R平方值大于0.99。

4.将加入总蛋白的样品的OD值带入X中，Y为浓度，上样体积为上样量÷（浓度×稀释倍数(此处为2)），如上样量为50ug，浓度为2.84384，则最后所加体积为50÷2.84384。

三.蛋白的处理
1.测量好蛋白浓度，再做WB时每次都加30ug蛋白（质量可变，可设定质量梯度），蛋白上样缓冲液Loading buffer 以5分1比例加入，算好体积并加好蛋白上样缓冲液后分装到小管，要多加一些，建议总上样量的2倍
2.煮蛋白，将机器预热到100℃后煮5min
3.放-80℃冻存
四.配液、配胶
5×电泳液：Tris 7.5g，甘氨酸36g，SDS 2.5g，定容至500ml母液，使用时稀释至1×，每个电泳槽2块胶时需1000ml电泳液，4块胶时需至少1500ml电泳液。

10×电转液：甘氨酸72g，Tris 15.4g，定容至500ml母液，4℃保存，使用时稀释：100ml 10×电转液＋150ml甲醇，定容至1000ml，每个电转槽需至少1500ml电转液。

TBST：NaCl 8g，Tris 3g，加DDH2O至900ml-950ml溶解后，调PH 7.4，定容至1000ml，最后加TWEEN20 1ml。

10%封闭液：5g脱脂奶粉，加TBST定容至50ml，每个培养皿需50ml。

抗体稀释液：5g BSA，加TBST定容至100ml，可多配一点4℃保存。

胶配方：
30%丙烯酰胺=29g丙烯酰胺+1g亚甲基双丙烯酰胺，DDH20定容至100ml
1.5M Tris 计算方式：Tris分子量×1.5=1L溶液中所需Tris的质量。

1.0M Tris 计算方式相同。

五.电泳
胶转到电泳夹子中，夹子要夹紧尽量不要漏电泳液，将夹子放入电泳槽中，黑对黑，红对红，加入电泳液后拔出梳子加样本，最左及最右尽量不要加样本。

Marker加5ul并加入6ul 5×蛋白（根据Marker说明书，此处为直接加Marker 5ul）。

将电泳槽放入冰块中，80V，3h（时间不定，看实际情况），使loading buffer跑到指示线即可。

六.电转
电泳结束后取出胶切掉无用部分。

PVDF膜先用甲醇先泡1min，裁剪滤纸，滤纸大小＞膜＞胶，用一大托盘，里面倒入电转液，将胶、海绵、滤纸、甲醇浸泡过的PVDF膜放入电转液中，需完全浸湿。

搭建三明治结构：夹子黑面（负极）在下，白面（正极）在上，在黑面上依次放置海绵、3层滤纸、胶、PVDF膜、3层滤纸、海绵，每放一层需倒入少许电转液以避免产生气泡，将夹子夹紧，务必保证每层之间没有气泡，需在PVDF膜上标记以确定蛋白面。

将三明治结构放入电转槽中，黑对黑，红对红，电转槽中倒入电转液，电转液需没过三明治结构，将电转槽放入冰块中，200mA，2h（需根据蛋白分子量调整）。

七.封闭
将电转好的PVDF膜取出，放于封闭液中，保鲜膜覆盖，在摇床上40转左右，2小时。

封闭后，将PVDF膜取出，在TBST中清洗3遍，摇床140转左右，每遍6min。

根据Maker将所需要的区段及Actin抗体所显影区段分别裁剪下来。

八.敷一抗，洗一抗
根据抗体说明书使用抗体稀释液稀释一抗，4℃敷一抗摇床慢速至少过夜。

需稀释后一抗3ml，将PE手套裁剪，包裹所需PVDF区段，封口机封口，仅留上端开口，将
一抗加入，完全排出气泡后，用封口机封闭，4℃敷一抗摇床慢速至少过夜。

Actin抗体同上。

敷一抗结束后用TBST洗3遍，摇床140转左右，每遍6min。

九.敷二抗，洗二抗
根据抗体说明书使用抗体稀释液稀释二抗，敷二抗摇床40转左右，1小时。

需稀释后二抗2ml，取一个培养皿，其上放置一张封口膜，需完全覆盖培养皿底部，其上按PVDF膜区段大小滴入二抗，将敷二抗PVDF膜蛋白面朝下放于二抗上，完全排出气泡，保鲜膜覆盖后放于摇床40转左右，1小时，Actin同上。

结束后用TBST洗3遍，摇床140转左右，每遍6min。

十.显影
配置ECL试剂盒，A液：B液1：1。

需提前开启设备降温，将PVDF膜蛋白面朝上放于暗盒板上，显影液滴在PVDF膜蛋白面上，孵育30s后将膜上多余显影液吸干，仅保持膜上湿润，使用电脑可直接读取条带。