动物组织中盐酸克伦特罗

动物组织中盐酸克伦特罗（瘦肉精）测定的前处理过程

主讲人：abc_1982

活动时间：2011年4月11日——4月25日

热烈欢迎abc_1982在极限色谱柱版面和大家一起讨论瘦肉精的前处理过程！

前言：

克伦特罗：学名盐酸克伦特罗；分子式：C12-H18-Cl2-N2-O

白色或类白色的结晶粉末，无臭、味苦，熔点161℃，溶于水、乙醇，微溶于丙酮，不溶于乙醚。是一种平喘药。该药物既不是兽药，也不是饲料添加剂，而是肾上腺类神经兴奋剂。

“瘦肉精”的来历：

在中国，通常所说的“瘦肉精”是指克伦特罗(它曾经作为药物用于治疗支气管哮喘，后由于其副作用太大而遭禁用),它可以增加动物的瘦肉量、减少饲料使用、使肉品提早上市、降低成本。在上世纪90年代,国内错误的把其作为饲料添加剂使用在猪饲料中,因此叫做”瘦肉精”。但随着其明显的副作用显现, 轻则导致心律不整，严重一点就会导致心脏病,国际上已经禁止其使用在饲料中.我国也于199 7年开始全面禁止使用。

无论什么样品的检测，其前处理的好坏直接影响到最后样品的检测结果。而对时下大家较为关注的“瘦肉精”问题，已经严重的影响到了大家的日常生活。对于瘦肉精检测的方法有酶联免疫吸附法（ELISA ）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-质谱法（GC-MS）三种，目前使用GC-MS较多，因为其检测限低，但这些方法的前处理过程是一样的。因此，今天我们将重点和大家一起分享“瘦肉

精”检测的前处理过程。

一.适用范围

适用于动物肌肉和肝脏中盐酸克伦特罗药物检测的前处理过程。

二.处理过程

1.提取

1.1 将5g动物组织、15 mL乙酸乙酯、3 mL10%碳酸钠溶液置于50 mL离心管中，10000 rpm均质2 min。6000 rpm下离心2 min，将上清液转至另一离心管中。用15 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并提取液。

1.2 向乙酸乙酯提取液中加入5 mL 0.1 mol/L的盐酸溶液，涡动1 min，然后再6000 rpm下离心1 min，收集下层水相。重复萃取一次，合并下层水相，用

2.5 mol/L NaOH溶液调节pH至5.2，待净化。

注意事项：

剪样时，对于肌肉组织来说，需要将肌肉中的肌膜，脂肪除去干净；对于肝脏组织来说，需要将筋膜等去除。

盐酸克伦特罗为弱碱性药物，在碱性条件下（pH-pKa>2）时，盐酸克伦特罗以分子形式存在，易溶于乙酸乙酯；提取的第一步中采用10%的Na2CO3溶液碱化基质，再用乙酸乙酯将其萃取出来；在第二个步骤中，通过加入5 mL的0.1 M的盐酸溶液酸化基质，这时候盐酸克伦特罗以离子形式存在，更容易溶于水中，从而被反萃取到水溶中。

2.净化

2.1 活化/平衡：依次向Welchrom® P-SCX（60mg/3mL）中加入3 mL甲醇、

3 mL水和3 mL 30 mmol/L盐酸溶液，流出液弃去；

2.2 上样：将上述提取液加入柱中，流出液弃去；

2.3 淋洗：依次用3 mL水、3 mL甲醇淋洗，淋洗液弃去，并将小柱抽干；

2.4 洗脱：用2×2 mL 5% 氨化甲醇洗脱，收集洗脱液，40℃下氮气吹干。

注意事项：

上样时请注意控制流速，因为克伦特罗与吸附剂之间是离子作用力，这种作用力的形成需要时间，如果流速太快会导致保留不住，建议在重力作用下自流，如果加压，控制流速不超过1 mL/min。

采用0.1M盐酸水溶液反萃完盐酸克伦特罗后，对于P-SCX小柱来说，可以不用NaOH溶液回调pH至5.2。因为方法参考的是NY/T 468-2006标准，原标准中采用的硅胶基质的强阳离子交换小柱，硅胶在pH 2-7.5之间稳定，而聚合物基质的P-SCX则在pH 1-14中均稳定存在。

3.样品：

用1ml50%甲醇溶解得到残渣，振荡1min使溶解，过0.22um尼龙针式滤膜，即得。

版友部分问题及回复汇总：

1.问题：活化平衡时加入3 mL甲醇、3 mL水和3 mL 30 mmol/L盐酸溶液原理是什么呢，呵呵没用过这种萃取柱是一般步骤啊还是月旭本款小柱特有步骤答复：这个是一般步骤，甲醇的目的是活化，主要润湿柱体，同时也可以清洗掉小柱中可能存在的干扰物，后面的水和稀盐酸为平衡步骤，为后面的上样提供一个合适的环境。

2.问题：在提取步骤，用氢氧化钠调节PH值，一般是采用什么设备来看PH 值，精度要求如何？

回复：采用pH计就可以了，规定要求是调整到pH5.2的目的是因为在这个pH 环境下，盐酸克伦特罗以阳离子形式存在，但是当pH低于5.2时，盐酸克伦特罗也以分子形式存在，故采用pH试纸监测pH也可以，这时可以将值适当的放低一点。

3.问题：上样时，很难过柱，这是什么原因造成的？有哪些方法可以解决？[/quote 答复：您说的很难过柱是指流速偏慢还是指堵柱子，如果是流速慢的话，可以给你负压，但是要控制流速，因为离子相互作用力的形成需要时间，所以流速不易太快。如果是堵柱子的话，那就可能是您样品的问题了。采用这个方法的话由于共萃取出来的脂类物质比较少，上样应该不存在这样的问题，请问你使用的是什么小柱，什么规格的。

问题：谢谢老师那么这个过柱子时的流速有没有个规定的或者是合适的范围呢答复：不同填料、不同的目标化合物、甚至你的上样量都与你选择的最终流速有关，对于反相来说，由于反相作用力较弱，更溶液形成，流速可以适当的快一点，一般流速在1-10 mL/min，具体的需要看您的上样量。对于离子交换来说，由于作用力的形成需要更长的时间，需要适当降低流速。

4.问题：各位老师有做过饲料中β—兴奋吗？这几天在做，根据农业部公告，上液质，用盐酸甲醇超声提取，离心后上清液过MCX小柱，氮吹后用流动相溶解上液质，外标法定量，可是回收率低得可怜呵。沙丁胺醇和克伦特罗回收率60-70%，莱克多巴胺只有24%。郁闷中，有做过的老师请指教啊

回复：饲料的却是没有做过，可以先判断回收率低的原因，确定是哪一个步骤出了问题，再对症下药。液质的基质效应很强，考虑是否可能是基质效应引起的离子抑制。