小鼠肝脏DNA提取与鉴定

小鼠肝脏DNA提取与鉴定

发布日期：2008-07-17 来源：生技网信息中心浏览次数：652

实验原理： DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中。蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E &nbs

实验原理：

DNA 以核蛋白形式存在于细胞核中。蛋白酶K 或链霉蛋白酶 E 均为广谱蛋白酶，其重要特性是能在 SDS 和 EDTA 存在下保持很高的活性。在匀浆后提取 DNA 的反应体系中， SDS 可破坏细咆膜、核膜，并使组织蛋白与 DNA 分子分离， EDTA 抑制细胞中 DNase 活性，蛋白酶 K 或链霉蛋白酶 E 将蛋白质降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分离出来。再用酚、酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去 DNA 溶液中微量酚的污染。最后用无水乙醇沉淀 DNA 。为获得高纯度 DNA ，操作过程中常加入 RNase 除去 RNA 。获得高分子量 DNA 的关键是防止 DNase 降解 DNA 。故标本必须新鲜，在提取前细胞就保持完整，核、溶酶体等细胞器应没有明显破坏，提取 DNA 用的离心管等器皿及试剂应消毒。操作在4 ℃以下进行。

试剂及器材

1 ．试剂

蛋白酶 K ：称取 20mg 蛋白酶 K 溶于 lml 消毒双蒸水中，－20 ℃备用。

RNase( 牛胰 ) ：称取 10mgRNase 溶于 lml 下列混合液中： 10mmol/l Tris-HCl ，pH8.0 ； lmmol/L EDTANa2 pH8.0 ； 50 %甘油。

10 %SDS 溶液：称取 10gSDS 溶于 100ml 消毒双蒸水中，于65 ℃保温 2 小时，贮存室温备用。

1 × TE 缓冲液 (pH8.0) ： 10mmol/L Tris-HClpH8.0 ； lmmol/LEDTANa

2 pH8.0 。配制后高压灭菌， 4 ℃贮存。

1 × TE 饱和重蒸酚 (pH8.0)

氯仿/异戊醇 (24:1V/V) 10mol/LNH4 AC ，配制后高压灭菌，4 ℃贮存

无水乙醇 (AR)

70 %乙醇

2 ．器材

玻璃匀浆器；离心机；电泳仪；电泳槽；紫外透射反射分析仪。

实验操作

1 ．组织 DNA 的提取

1) 取小鼠新鲜肝组织，去除结缔组织，用剪刀剪成细小碎块

2) 加 10 倍体积 TE 缓冲液，用玻璃匀浆器在冰浴中中速匀浆

3) 将匀浆液转入 10ml 离心管以 4000rpm 离心 10 分钟，弃上清

4) 加 10 倍体积 TE 洗一遍，以 4000rpm 离心 10 分钟，弃上清

5) 加适量 TE 稀释

6) 取 400μl 稀释液于 1.5ml 的 Eppendorf 管，缓慢加入 10 %SDS 溶液，至终浓度 0.5 % ( 加 20μ1) ，摇匀直至溶液变粘稠

7) 加入 Rnase(200μg/m1) 至终浓度 20ug/m1(42μl) 混匀，置37 ℃保温 60 分钟总体积 (420μ1) 。

8) 加蛋白酶 K(20mg/m1) 至终浓度 100ug/m1 混匀 ( 加 21u1) ，于50 ℃保温 3 小时，并间歇搅动 ( 总体积 441μ1) 。

9) 将此溶液冷却至室温，加等体积饱和酚抽提，以 10000rpm 离心 10 分钟。

10) 取上清加 1/2 体积饱和酚， 1/2 体积氯仿／异戊醇抽提一次，以 10000rpm 离心

10 分钟

11) 取上清，加等体积氯仿/异戊醇抽提一次，以 10000rpm 离心 10 分钟

12) 加 1/10 体积 5MKAc ，加 2 倍体积无水乙醇充分混匀，以 12000rpm 离心 10 分钟

13) 加 lml70 %乙醇洗沉淀，以 12000rpm 离心 10 分钟

14) 待酒精挥发尽后加 20ul TE 溶解，4 ℃储存

2 ．电泳鉴定

取 DNA 样品 2μ1 加上样缓冲液 10μ1 ( 含溴酚蓝指示剂和甘油 ) ，在 0.8 %琼脂糖凝胶进行水平微型电泳，电压 <5V/cm ，时间 2 小时左右。电泳后取出凝胶，用 0.5μg /ml 的溴化乙锭染色 20 分钟，用紫外灯观察分析。