核酸的分析技术

一.核酸的提取
2. 质粒提取 一般流程 菌体破碎
碱裂解 SDS+ 醋酸钾
沉淀杂质 氯仿/异戊醇抽提
有机溶剂沉淀 溶解（TE)
乙醇沉淀
一.核酸的提取
3. RNAຫໍສະໝຸດ Baidu取
P103
提取过程与DNA提取相似。
严格避免RNase的作用！ 常用的方法：异硫氰酸胍
Trizol
二.核酸的检测
1. 核酸电泳
Gel electrophoresis
三. PCR技术
PCR：polymerase chain reaction 聚合酶链式反应
用于扩增位于两段已知序列之间的DNA片段。
三. PCR技术
引物2 模板 引物1 （10-30 bp）
DNA聚合酶
dNTP Mg2+
根据已知信 息设计引物 序列
三. PCR技术
热 变 性 退火 延 伸
I
三. PCR技术
热 变 性 退火 延 伸
I
三. PCR技术
退 火
延 伸
II
三. PCR技术
以此类推，呈几何级增长 一般进行25-35个扩增循环 DNA可扩增106~109倍
三. PCR技术
PCR 的应用
基因克隆； DNA文库筛选； 直接测序； 研究进化关系； 品种鉴定、转基因检测； 环境中致病菌和指示菌的检测等。
基因（gene)：DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列， 其编码产物是多肽链或RNA。 基因组(genome)：一种生物体的全部基因或染色体。 基因组学 (genomics) ：一门涵盖了对所有基因进行基因组 作图、核苷酸序列分析、基因定位和功能分析的科学。包 括 结 构 基 因 组 学 (structural genomics) 和 功 能 基 因 组 学 (fuctional genomics )。 生物信息学 (bioinformatics) ：将计算机科学和数学应用于 生物大分子信息的获取、加工、存储、分类、检索与分析， 以达到理解这些生物大分子信息的生物学意义的交叉学科。
一.核酸的提取
1. DNA提取
根据不同的实验材料和实验 目的选用合适的实验方法！
SDS法 CTAB法
一.核酸的提取
2. 质粒提取
质粒是独立于细菌染色体外能进行复制和遗传的辅助 性遗传单位。 1-200 Kb;
共价闭合环状；
编码某些酶、抗生素、毒素；
易于操作。
常用作克隆或表达载体。
琼脂糖水平凝胶
聚丙烯酰胺垂直胶
二.核酸的检测
1. 核酸电泳
Gel electrophoresis M 点样孔
核酸条带
二.核酸的检测
1. 核酸电泳
Gel electrophoresis
可以检测核酸的 完整性
纯度
分子量
二.核酸的检测
2. 紫外吸收
计算浓度：A260nm 检验纯度：A260/A280
Maxam-Gilbert化学降解法
五.序列分析
DNA测序仪: 采用毛细管电泳技术取代传统的聚丙烯酰胺平板电泳，应 用该公司专利的四色荧光染料标记的 ddNTP(标记终止物 法)，因此通过单引物PCR测序反应，生成的PCR产物则 是相差1个碱基的3'末端为4种不同荧光染料的单链DNA混 合物，使得四种荧光染料的测序 PCR 产物可在一根毛细 管内电泳，从而避免了泳道间迁移率差异的影响，大大提 高了测序的精确度。由于分子大小不同，在毛细管电泳中 的迁移率也不同，当其通过毛细管读数窗口段时，激光检 测器窗口中的 CCD(charge-coupled device) 摄影机检测器 就可对荧光分子逐个进行检测，激发的荧光经光栅分光， 以区分代表不同碱基信息的不同颜色的荧光，并在 CCD 摄影机上同步成像，分析软件可自动将不同荧光转变为 DNA序列，从而达到 DNA 测序的目的。分析结果能以凝 胶电泳图谱、荧光吸收峰图或碱基排列顺序等多种形式输 出。
一.核酸的提取
1. DNA提取 一般流程 组织细胞破碎
提取液浸提 酚/氯仿/异戊醇抽提
有机溶剂沉淀 溶解（TE) 纯 化
一.核酸的提取
1. DNA提取 注意事项
DNA的纯度可以满足下游操作的要求；
所得DNA必须完整；
DNA应有足够的量； 操作程序简便，快捷，价格低廉，避免使 用有毒试剂。
四.分子杂交
Southern blotting
Northern blotting
四.分子杂交 主要步骤
核酸（酶切）电泳； 变性、转膜； 探针标记； 杂交反应； 检测；
四.分子杂交 应用于
未知基因克隆； 文库筛选； 物种亲缘性分析； 表达情况分析； ……
五.序列分析
Sanger双脱氧链终止法