基因工程第二章基因工程工具酶优秀课件

Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
G CCTAG
+GATCGC
BstⅠ
GGATCC CCTAGG
GCCTAG+
GATCC G
同尾酶
有些限制性内切酶虽然识别序列不完全 相同，但切割DNA后，产生相同的粘性末端， 称为同尾酶。这两个相同的粘性末端称为配 伍未端(compatible end)。
Bam HⅠ GGATCC CCTAGG
GGATCC CCTAGG
切口 ：平端切口、粘端切口
HindⅡ
GTCGAC CAGCTG
Bam HⅠ
GGATCC CCTAGG
GTC CAG
+
GAC CTG
平端切口
G+
CCTAG
GATCC G
粘端切口
5’ 粘端切口
EcoRⅠ
GAATTC CTTAAG
G
AATTC
CTTAA
G
3’ 粘端切口
PstⅠ
实际上，这些假设不可能完全有效。
如，λDNA分子，49kb， GC的含量要少于50％。
对一个六核苷酸识别序列的限制性内切酶来说应该 具有12个酶切位点。
实际上，这些识别位点发生的频率要小一些，
如：BglⅡ有6个， BamHI有5个， SalI则只有2个。
同功异源酶
来源不同的限制酶，但能识别和切割 同一位点，这些酶称同功异源酶。
独立的内切酶和甲基化酶
短小的回文序列（多数4-6bp） 同于或接近于识别部位 Mg2+
三、限制性核酸内切酶的命名
H.D.Smith等于1973年提议的命名系统。 名称的第个1字母取自它来源细菌属名的第1个字母，大写； 第2，3二个字母取自它来源细菌的种名的头2个字母，小写； 如果它的来源菌还有株系，则有第4个字母；若酶的编码基因
位于噬菌体或质粒上，则用一个大写字母表示此染色体外的遗 传成分； 最后用大写罗马数字，代表同一菌株中不同限制酶的编号。
前三个字母用斜体表示。
命名
Hin dⅢ Haemophilus influenzae d株
流感嗜血杆菌d株的第三种酶
属种 株 序
第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写； 第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写； 第四个字母代表株； 用罗马数字表示发现的先后次序。
基因工程第二章基 因工程工具酶
工具酶 -----DNA分子的切割和连接技术。
Smith发现了第一个Ⅱ型限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease，RE) 对DNA分子有特异地 切割作用。（手术刀剪）
Khorana又发现了T4DNA连接酶（Ligase），能 将DNA片段连接在一起。（缝纫机、浆糊）
DNA、RNA聚合酶和反转录酶等合成酶。（复印机）
构成了一个研究DNA、 RNA分子的工具酶箱。
第一节 限制性核酸内切酶
限制性核酸内切酶 是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
一、宿主的限制和修饰现象----发现
1952～1953年在T偶数噬菌体和λ 噬菌体对 大肠杆菌的感染实验中研究者发现了细菌的限制 和修饰现象。正是对限制和修饰现象的深入研究， 导致限制性内切核酸酶的发现。
这些酶的发现是基因工程发展过程中的一项突破 性进展。
二、限制性核酸内切酶的类型
根据其识别和切割序列的特性、催化条件及修 饰活性等，一般将限制酶分为I，Ⅱ，Ⅲ 三大类。
I 类：不适用于基因工程。只在肠道菌中发现。 Ⅱ类：基因工程的工具酶。 Ⅲ类：切割位点不在识别位点，一般离识别位点24 bp～ 26 bp，对分子克隆操作亦无实用意义。
已有超过1200种。
性质
蛋白质结构和 功能
识别部位
切割部位 限制作用所需 的辅助因子
I型限制性核酸内切酶
由3个亚基组成的复合功能酶；
α内切酶活性，β甲基化酶活性，γ特异性识别序列
不对称序列AACN6GTGC
非特异性，距识别部位大于1000bp
ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸
性质
蛋白质结构和 功能
寄主控制的限制与修饰现象由两种酶活性配合完成的， 一种叫修饰的甲基转移酶，另一种叫核酸内切限制酶。
寄主控制的限制与修饰的作用， 一是保护自身的DNA不受限制； 二是破坏外源DNA使之迅速降解。
根据限制-修饰现象发现的核酸内切限制酶，现 在已成为重组DNA技术学的重要工具酶。纯化后的 限制性内切酶允许分子生物学家以一种精确的可重复 的方式切割基因克隆所需的DNA分子。
CTCGAG GAGCTC
CTCGA G
G AGCTC
DNA分子中识别序列的出现频率
对特定的限制性内切酶来说，在已知长度的DNA 分子中,识别序列的数量能够通过数学方法计算出来。
这一算法假定核苷酸以一种随机方式排列而4个不 同核苷酸以相同的比例出现(例如GC含量：50％)。
一个四核苷酸序列(如GATC的酶)每44=256个核 苷酸出现一次。
所有的限制酶，除了以上名称外，前面还冠以系 统名称 内切酶系统名称 R；甲基化酶系统名称 M。 例如 R. Hind Ⅲ，表示内切酶
M. Hind Ⅲ，表示甲基化酶 Leabharlann Baidu现在限制性内切酶名称中的 R 省略不写。
通常情况下，需要对克隆的DNA进行切割。
首先，如果以克隆单个基因为目的，该单个基因 可能仅仅包含2-3kb DNA，则这个基因不得不从大的 (通常情况下超过80kb)DNA分子中切割出来。
其次，大的DNA分子不得不被切断成小的足以被 载体携带的片段。
绝大多数克隆载体能够承载的DNA片段处于一个 特定的大小范围中。
比 如 ， 以 M13 噬 菌 体 为 基 础 的 载 体 ， 所 克 隆 的 DNA分子超过3kb时运载效率非常低。
四、 Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特征
Ⅱ型限制性核酸内切酶的基本特性 识别双链DNA分子中4--8对碱基的特定序列大部 分酶的切割位点在识别序列内部或两侧识别切割序列 呈典型的旋转对称型回文结构(palindrome) 。
Bg lⅡ AGATCT TCTAGA
识别部位
切割部位 限制作用所需 的辅助因子
Ⅲ型限制性核酸内切酶
由2个亚基组成的双功能酶；
M亚基位点识别与修饰，R亚基内切活性
5-7bp的不对称序列
非特异性，距识别部位一侧24-26bp
ATP、Mg2+、S-腺苷甲硫氨酸
性质
蛋白质结构和 功能
识别部位
切割部位 限制作用所需 的辅助因子
Ⅱ型限制性核酸内切酶