southern 印迹法

实验七Southern印迹法

[目的]

１．熟悉Southern 印迹法的基本操作方法和主要步骤的工作原理。

２．了解Southern印迹的意义。

[原理]

Southern印迹法(Southern Blot)是将基因组 DNA经限制性内切酶酶解、琼脂糖凝胶电泳分离，使DNA片段按分子量大小排列在琼脂糖凝胶上；经碱处理凝胶使DNA变性(使双链DNA变成单链)，通过具有一定盐离子浓度溶液的虹吸作用，将凝胶中变性的单链DNA片段原位地吸印到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上；•经过干燥或紫外线照射处理，单链DNA片段的极性基团与支持膜上的基团结合而使DNA分子牢固地固定到转移膜上；转移后的单链DNA 分子与32P或35S标记的DNA探针按互补原理进行杂交；经放射自显影对特定位置上显现的特异DNA片段进行分析。这种方法最初是由Southern于1975年建立的。方法中DNA转移的方式和复印的过程一样，比较准确地保持了特异DNA顺序在电泳图谱中的位置（也可将变性的凝胶负压干燥后与特定的DNA探针进行原位杂交）。它把电泳分离和杂交结合起来，不但能检测出特异的DNA序列片段，而且能进行定位和测定分子量。即先以电泳后照相记录的已知分子量的DNA片段(常用Hind Ⅲ或EcoRⅠ降解的λDNA)为标准，精确测量各标准片段与电泳原点之间的距离。以DNA的Log10kb为纵坐标，移动距离(cm)为横坐标，连接各已知条带相应的点，得到一条标准曲线。然后测量未知条带(放射自显影后获得的特异片段)的移动动距离，在标准曲线上找出相应的Log10kb值，以此计算出其分子量大小。

[器材与试剂]

一、器材

1．电热真空干燥箱

2．硝酸纤维素滤膜或尼龙膜

3．大方瓷盘、带盖方盘、玻璃板

4．滤纸、吸水纸、保鲜膜、蜡膜（Parafilm）、一次性手套等

5．刀片、刻度吸管、镊子、剪刀、lkg重物

二、材料

电泳分离DNA的琼脂糖凝胶

三、试剂

1．酸变性液:0.25mol/L HCl，用分析纯的盐酸（12Mol/L）稀释

2．碱变性液：0.5mol/L NaOH， 1.5mol/l NaCl（pH13.1）

3．中和液：0.5mol/L Tris·HCl(pH7.5),1.5mol/L NaCl

4．20×SSC: 0.3mol/Ｌ柠檬酸，3mol/L NaCl,pH7.0(配方见附录)

5．10×SSC和2×SSC：用双蒸馏水稀释20×SSC储存液

[实验步骤]

注意：操作戴手套！

1．凝胶处理:

1)凝胶照像后，切去包括标记带在内的多余部分，将凝胶的一角(•点第一个样品的一侧)切去作为标记，以便于定位。精确测量凝胶大小，然后将凝胶放入一个方形瓷盘中；

2)变性：将凝胶浸泡于适量的碱变性液中，室温下变性30分钟，期间更换变性液一次，不断地轻轻摇动（如果先进行酸变性酸变性，则凝胶中溴酚兰的颜色由黄变兰）。对于较大的DNA片段(•如大于15kb)，凝胶可在碱变性前用0.25mol/L HCl预处理10分钟使DNA片段脱嘌呤（凝胶中溴酚兰的颜色由兰变黄）后再进行碱变性；

3)中和：移去瓷盘中的碱变性溶液，用双蒸馏水漂洗凝胶两次，然后浸泡于适量的中和液中，室温下轻轻摇动15分钟，更换新鲜中和液，再中和15分钟；

2．膜处理

1)剪下一张与凝胶面积相同的硝酸纤维素膜(NCP)或尼龙膜（NL）。注意NCP也要剪去一角且不可用手触摸，粘有油腻的膜不能被湿润，也不能结合DNA。同时剪8～10张与NCP等大的干净滤纸；

2)将NCP与3～4张滤纸依次漂浮于盛有双蒸馏水的带盖方盘中，使水自然从NCP的下面向上浸润，待其完全浸湿后，连同浸湿的滤纸一起浸入于转移液中浸泡5～10分钟。• 注意：在蒸馏水中如NCP表面有气泡时，可将其放在65水浴中浸泡几分中，仍有气泡或不能完全被湿润(膜上有白色或黄色斑块)则不能用于转移。

3．转移

1)取一个较大的方形瓷盘，放一块玻璃板于盘上，盘内加转移液(6×SSC或10×SSC)使液面距离玻璃底面约1～2cm，玻璃板表面盖两张预先用转移液浸润的Whatman 3M •滤纸(也可用新华滤纸)，滤纸两端浸入SSC转移液中，用一玻璃棒将滤纸压平，滤纸与玻璃板间不得有气泡；

2)将琼脂糖凝胶翻转(样品孔朝下)后置于上述铺有Whatman 3M•滤纸的平台上，注意:两者之间不能有气泡。

3)用parafilm 蜡膜将凝胶四周平台上裸露的滤纸封严，防止在转移过程中因短路(转移液直接从盘中流向吸水纸而不经过凝胶)使转移效率降低，甚至转移失败；

4)将处理好的NCP(已切去一角)小心地覆盖在凝胶上(滤膜的光泽面即标有N.C字样的一面朝向凝胶)，NCP的一端与凝胶的上样孔对齐，切去的一角与凝胶切角的位置对齐。

注意：滤膜与凝胶之间不能有气泡，且NCP一旦与凝胶接触即不可再移动，因为从接触的一刻起，DNA已开始转移；

5)将预先用转移液浸润过的与NCP大小相同的Whatman 3M滤纸覆盖在硝酸纤维素膜上，排出滤纸与膜之间的气泡；

6)再放几张相同大小的干滤纸和一叠厚约10～15cm的吸水纸于滤纸上，顶部压一块玻璃板和1kg左右的重物。

7)静置12～15小时使其充分转移，其间换吸水纸1～2次。转移液在吸水纸的虹吸作用下从盘中转移到吸水纸上，从而带动DNA从琼脂糖凝胶中转移到NCP上；

8)转移结束，移去吸水纸和滤纸，在NCP上用铅笔标上点样孔的位置。•将NCP浸泡在2×SSC中5分钟以去除琼脂糖碎块。将膜放置于一张干燥的新鲜滤纸上；

9)在紫外灯下观察凝胶和NCP膜，以了解DNA转移的情况。•在紫外灯下凝胶不显示荧光，NCP膜呈桔红色，并可见到条状的DNA带。

10)把NCP置于两层干燥新鲜的滤纸间，真空下80℃烘烤2小时(亦可用其它方法)。此过程可使DNA更加牢固地固定于NCP上。

11)此NCP既可直接用于杂交，亦可用塑料薄膜密封，置－20℃冰箱保存备用。

[注意事项]

1．操作时戴手套，严禁用手接触凝胶和硝酸纤维素膜；

2．转移时，滤纸与膜、膜与凝胶、凝胶与滤纸桥之间均不能有气泡，否则影响DNA转移；

3．凝胶易碎，操作时应格外小心；

4．硝酸纤维素膜上的DNA固定非常重要，固定不好时DNA•在杂交过程中会脱落下来；烤膜温度过高，膜脆性增加，易碎；

5．大片段DNA转移效率低，可在碱变性前用0.25mol/L HCl浸泡凝胶10～15分钟，使DNA分子脱嘌呤或用短波(260mm)紫外光照射10～20分钟后再行碱变性、转移以提高大片段DNA的转移效率。

6．转移液中盐离子浓度对转移有较大影响。10×SSC条件适中，能有效地转移 1～20kb 的DNA片段，速度也比20×SSC快，比较常用：6×SSC转移速度最快，•对于高分子量DNA 片段(>10kb)的转移较理想，但小分子DNA易丢失。若转移DNA片段较小，则宜选用20×SSC。因此应根据不同目的选择适当的转移液。

[实验结果与思考题]

１．简述Southern 印迹所包括的主要步骤。

２．简述变性、转移和烤膜的目的和DNA在变性前、后，转移过程中以及转移到NCP 膜上时的主要存在形式。

３．为什么要进行Southern 印迹？Southern 印迹主要解决了什么问题？