免疫印迹法

步骤
免疫印迹法分三个阶段进行： 一、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE) 二、电转印 三、酶免疫定位（显色）
1、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)
阴离子去垢剂SDS能破坏蛋白 质中的氢键和疏水键，按一定 比例和蛋白质分子结合成复合 物，使蛋白质带负电荷的量远 远超过其本身原有的电荷量， 掩盖了各种蛋白质分子间的天 然电荷差异；加入巯基乙醇使 电泳的迁移率不再受原有分子 形状的影响。这样蛋白质的迁 移率就取决于其分子量的大小。
特点：HRP能激发化学发光显色底物发光，通过对X线胶片的曝 光，显影定影从而达到显色的目的。灵敏性很高且比较安全。
发光底物的配制： 2ml的A液+2ml的B液+6ml的SW。 摇床上与NC膜避光孵育5分钟。
总结
SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜
过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟 酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 DAB显色底物显色法显色 ECL显色法
电泳2小时
转印结果的检查：电泳结束后，用丽春红对NC膜预染下，观察转移 效果。随后用水冲洗掉丽春红的颜色，进行封闭。
3、酶免疫定位
封闭：将上述得到的NC膜，用封闭液在摇床上过夜封闭。为了防止免
疫试剂的非特异性吸附。
清洗：封闭时间达到后用PBST清洗NC膜3次左右，每次约15分钟。 一抗孵育：清洗好后，加入一抗标记2小时左右。一抗一般选择源于兔
色法中最常用的底物，可以和HRP作用形
成褐色不溶性产物。反应速度快，灵敏性 较高，特异性好。但是显色后光照数小时
会褪色不易保存。
DAB显色液的配方： 9ml的0.01mol/L Tris-Cl(pH7.6) 1ml的0.3%的CoCl2 DAB少许 10ul的H2O2
2.化学发光显色法(ECL法)
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三、电泳
恒压60V电泳1小时左右后可将电压调大至80V再跑2小时左右。
2、电转印(半干式转印法）
转印膜的顺序：两层滤纸-NC膜-SDS-PAGE胶-两层滤纸 在转 印Buffer中用玻璃棒轻轻赶走当中的气泡。
← 滤纸 ← 凝胶 ← NC膜 ← 滤纸
电转印电流大小及时间：恒流=0.8 mA/cm2
辣根过氧化酶相关显色法原理： 二抗上面带有辣根过氧化酶HRP，其能够显色底物显色以及能够使 发光基团发光，从而达到显色的目的。 常用的HRP显色方法有两种：1.底物显色法(DAB显色法） 2.化学发光显色法（ECL显色法）
1.底物显色法（DAB显色法）
特点：3‘3’二氨基联甲苯胺（DAB)是底物显
或小鼠。
清洗：一抗孵育好后，再次用PBST清洗3次左右，每次约15分钟。以
除去未结合的一抗。
二抗孵育：清洗好后，加入二抗标记1小时左右。二抗根据一抗的来源
选择适合的羊抗兔或羊抗鼠。
清洗：二抗标记好后，用PBST清洗3次左右，每次约15分钟。以去除
未特异性结合的二抗。
显色
放射性核素检测
显色方法
辣根过氧化酶相关显色法 碱性磷酸酶法
Thank you
基本步骤
一、蛋白样品的制备
经过IPTG诱导的细菌在适当的裂解液中进行裂解，按目的获取上清和沉淀， 再与蛋白质Loading Buffer在沸水中作用10分钟，获得蛋白质样品。
二、凝胶的制备
1.制胶器的安装 2.分离胶的配制：按照蛋白的大小按配方配制合适浓度的分离胶，加入 至制胶器中，用超纯水水封，以保证分离胶的液面平整。 3.浓缩胶的配制：待分离胶完全凝固后，倾去超纯水，按配方配制浓缩 胶加入其中，插上样品梳。
原理
经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤 维素薄膜）上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其 生物学活性不变。以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体 起反应，经过底物显色或放射 自显影以检测电泳分离的特异 性目的基因表达的蛋白成分。
免疫印迹法
商宇伟
定义
免疫印迹法（immunobiotting test，IBT） 也被称作酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoeletrotransfer blot，EITB），是 20世纪70年代末，发展起来的一门蛋白质多参 数检测技术。由于其与早先建立的核酸印迹法 southern blot相类似，所以习惯上又叫westernblot。