虫草素调控eIF2α／TGF—β／Smad信号通路改善肾间质纤维化的机制

虫草素调控eIF2α／TGF—β／Smad信号通路改善肾间质纤维化的
机制
目的：观察冬虫夏草主要有效成分——虫草素（cordycepin）对肾间质纤维化及其eIF2α/TGF-β/Smad信号通路的干预作用和机制。

方法：将15只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和虫草素组，建立小鼠单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化模型，虫草素组小鼠经皮下注射虫草素（5 mg·kg-1·d-1），同时，以生理盐水干预对照组和模型组，共5 d。

实验结束后，取小鼠结扎侧的肾脏，观察肾间质纤维化病理特征，并测定肾组织I型胶原（collagen type I，Col I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）核酸表达（Northern blot）；另外，在体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E 细胞），在转化生长因子（transforming growth factor，TGF）- β联合或不联合虫草素干预后，观察I型胶原、IV型胶原（collagen type IV，Col IV）核酸表达的变化（Northern blot），并检测eIF2α、磷酸化eIF2α（phosphorylated eIF2α，p-eIF2α）以及Smad2/3、磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3）蛋白表达的变化（Western blot）。

结果：虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化，包括纤维化的病理特征以及I型胶原、α-SMA核酸的表达；虫草素在体外促进NRK-52E 细胞p-eIF2α的高表达，抑制TGF-β诱导的p-Smad2/3以及I型、IV型胶原的表达水平。

结论：虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用，它可能是通过诱导eIF2α磷酸化，抑制TGF-β/Smad信号通路中的关键信号分子——p-Smad2/3表达，减少肾组织胶原和α-SMA表达等途径而改善肾间质纤维化。

标签：虫草素；肾间质纤维化；eIF2α/TGF-β/Smad信号通路
肾间质纤维化是各类慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）发展至终末期肾病的基本环节[1]。

目前，冬虫夏草（cordyceps militaris）及其制剂在临床上被广泛应用于治疗各种CKD，而且，对肾脏纤维化有一定的改善作用[2]。

研究表明，冬虫夏草制剂可以拮抗5/6肾切除大鼠肾脏纤维化的进展[3]，还可以减少糖尿病大鼠肾组织转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β的产生以及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、IV型胶原（collagen type IV，Col IV）的表达[4-5]。

虫草素（cordycepin）是冬虫夏草的主要有效成分[6]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、抗衰老等多种功效[7-8]。

据报道[9]，虫草素可抑制TGF-β信号及其诱导的α-SMA和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）合成。

然而，虫草素保护肾损伤的深层作用机制尚未完全阐明。

真核翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eIF）2α在真核生物核酸翻译起始过程中介导起始转移核糖核酸（trasfer RNA，tRNA）与核糖体的结合，它是核酸翻译的关键调控因子之一。

激活eIF2α可抑制eIF2β亚单位活性，影响eIF2-GTP形成，进而引起核酸翻译受阻[10]。

据报道，在水貂的肺上皮细胞（Mv1Lu细胞）中，过度表达的eIF2α可以直接抑制TGF-β的应答，干扰其下游相关信号蛋白的合成与表达[11]；笔者既往研究[12]表明，虫草素可促进eIF2α磷酸化。

因此，笔者推测，虫草素可能通过活化eIF2α信号，引起翻译
抑制，发挥调控Smad信号通路活性的作用。

在本课题中，笔者首先在体内观察虫草素对小鼠单侧输尿管结扎术（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化模型的干预作用；其次，通过体外实验，观察虫草素对肾小管上皮细胞eIF2α磷酸化及TGF-β/Smad信号通路的影响，最终，揭示其改善肾间质纤维化的可能机制。

1 材料
1.1 动物体重约20 g的C57BL/6雄性小鼠（SPF）购自并饲养于日本山梨大学（University of Yamanashi）动物实验中心。

所有小鼠均给予标准饮食，并自由饮水。

小鼠适应性饲养1周后开始正式实验。

1.2 药物与试剂虫草素购自Sigma-Aldrich公司，重组TGF-β购自R&D System公司。

抗总eIF2α抗体购自Santa Cruz Biotechnology，抗磷酸化eIF2α（phosphorylated eIF2α，p-eIF2α）抗体、抗α-SMA抗体、抗磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3）抗体、抗Smad2/3抗体、β-actin抗体以及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的相应二抗均购自于Cell Signaling公司。

总RNA提取试剂盒购自Promega公司。

2 方法
2.1 肾间质纤维化模型制作参照Chevalier的方法[13]进行UUO手术。

小鼠经麻醉后分离左侧输尿管，以0号丝线在2处不同部位完全结扎；对照组仅接受麻醉、打开腹腔并分离左侧输尿管，但不进行结扎操作。

2.2 动物分组及给药将15只小鼠随机分为3组，即对照组、模型组和虫草素组。

自建立UUO模型当日开始，虫草素组小鼠经腹腔注射给予虫草素（5 mg·kg-1·d-1），对照组和模型组小鼠仅给予同体积的生理盐水，每日1次。

在手术后第5天处死小鼠，并分离左侧肾脏，用于组织学染色、免疫组织化学染色（简称“免疫组化”）以及核酸、蛋白质分析。

2.3 细胞培养及干预措施体外培养实验采用大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞）进行（购自日本ATCC细胞库）。

使用DMEM/F-12培养液（Hyclone公司）+5% FBS（Sciencell公司）+1×105 U·L-1的青、链霉素（Hyclone 公司）；在37 ℃，5%CO2培养箱中进行培养。

每天观察细胞数量及形态，待细胞生长汇合至80%时，用0.25%的胰蛋白酶（Hyclone公司）消化5 min，至贴壁细胞漂浮后，予5 mL含5%FBS的完全培养基终止消化，轻轻吹打，制成单细胞悬液，于低速离心机中1 000 r·min-1离心4 min，吸引器吸出上清液，往分离出来的细胞团块中加入适量培养基，吹打混匀。

取处于对数生长期的细胞进行实验。

体外实验中加入虫草素（0.5，1，5 mg·L-1），联合或不联合TGF-β（5 μg·L-1）进行干预。

2.4 蛋白质分析采用Western blot进行蛋白质分析。

将分离的肾皮质加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的总蛋白裂解液中，在电动匀浆机匀浆后，离心，取上清液。

提取总蛋
白后，采用二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）法测定蛋白浓度。

配制分离胶和积层胶。

将各样本20 μL与等量的蛋白上样缓冲液混匀，在沸水中煮5 min，各取30 μL分别加样，在电泳槽中加满电泳缓冲液进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE）凝胶电泳。

电泳完毕后，取下凝胶，电转移至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜，用含5%脱脂奶粉和TBST缓冲液（20 mmol·L-1 TrisHCl，150 mmol·L-1 NaCl，0.05% Tween 20）封闭2 h。

加入相关待测定蛋白抗体，摇晃过夜。

洗涤PVDF膜，加入相应的二抗（1∶1 000），室温孵育1 h。

取出PVDF膜，置于显色液（DAB显色试剂盒）中显色，定影。

用Quantity one 4.1.1软件（Bio-Rad）进行吸光度分析，结果分别与β-actin或eIF2α吸光度对照，其比值表示蛋白相对表达量。

2.5 核酸分析采用Northern blot进行核酸分析。

根据总RNA提取试剂盒说明书的步骤进行，在细胞或组织中加1 mL Trizol reagent，反复均匀吹打，室温下放置5 min，吸取上清液置入Eppendorf管，再加入氯仿0.2 mL，低温条件下12 000 r·min-1离心15 min，取上清液，加入异丙醇0.5 mL，再次低温12 000 r·min-1离心15 min，弃上清液，用75%乙醇洗涤沉淀物，用Depc处理水溶解沉淀的RNA；取2 μL样本，分别用波长260，280 nm的紫外分光光度仪测定A，比值约等于2。

采用甲醛变性凝胶电泳法分离RNA。

Northern杂交采用含甲酰胺的杂交体系，42 ℃预杂交2～4 h后，加入标记的探针，然后42 ℃杂交过夜。

洗膜后，使用Typhoon激光分子成像系统进行观察并成像。

cDNA探针包括IV 型胶原[14]、I型胶原[15]及α-SMA[16]（日本山梨大学Miyazawa教授惠赠）。

用Quantity one 4.1.1软件（Bio-Rad）进行光密度分析，结果分别与GAPDH光密度对照，其比值表示核酸相对表达量。

2.6 肾脏病理分析肾脏摘除后分离并取少量肾上极皮质，固定于10%中性甲醛内，经脱水、透化后，石蜡包埋，切片厚度3 μm，常规进行Masson染色；光学显微镜下观察肾间质纤维化的组织特征。

2.7 免疫组化分析采用免疫组化观察肾组织α-SMA表达。

将肾组织石蜡切片（4 μm），常规脱蜡，水化，用含3%的H2O2封闭内源性过氧化物酶。

在37 ℃环境中用胰蛋白酶（1 g·L-1）修复抗原30 min。

加入一抗[单克隆抗体α-SMA（1∶100）]，4 ℃冰箱过夜。

磷酸盐缓冲液（phosphate-buffered saline，PBS）洗涤后加相应二抗[羊抗鼠IgG（1∶200）]，孵育20 min，二氨基联苯胺（diaminobenzidine，DAB）显色剂显色。

用ddH2O终止显色，苏木素复染1～2 min，兰化，常规脱水、透明、封片。

2.8 统计学分析采用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料以±s表示，多组间均数比较采用非参数Mann-Whitney U检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结果
3.1 虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化Masson染色结果显示，与对照
组小鼠比较，UUO组小鼠肾间质略有增宽，肾小管上皮细胞出现空泡变性，肾小管管腔扩大或萎缩；肾间质和肾小管出现广泛的胶原（collagen，Col）沉积；经虫草素干预，虽然模型鼠肾间质仍可见到肾小管管腔扩大，但是，其肾间质胶原沉积得到明显改善（图1）。

该结果说明，虫草素能减轻UUO模型鼠肾间质纤维化。

A.对照组；B.UUO组；C.虫草素组（图2同）。

图1 虫草素对UUO小鼠肾间质纤维化的影响（Masson染色，×400）
Fig.1 Effects of cordycepin on renal fibrosis in UUO mice（Masson，×400）
3.2 虫草素在体内减少模型鼠肾间质α-SMA表达免疫组化染色显示，与对照组小鼠比较，UUO组小鼠肾间质α-SMA阳性染色面积（棕黄色区域）明显增多；而虫草素组明显减少（图2）。

该结果说明，虫草素能减轻UUO模型鼠肾间质α-SMA表达。

图2 虫草素对UUO小鼠肾间质α-SMA表达的影响（× 400）
Fig.2 Effects of cordycepin on α-SMA expression in UUO mice（× 400）
3.3 虫草素在体内减少模型鼠肾组织I型胶原和α-SMA核酸表达Northern blot结果显示，与对照组小鼠相比，模型鼠肾组织I型胶原（collagen type I，Col I）和α-SMA核酸表达均上调，差异均有统计学意义（P＜0.05）；而虫草素干预能明显逆转其表达，并且，与UUO组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）（图3）。

与对照组相比1）P＜0.05；与模型组相比2）P＜0.05（图4同）。

图3 虫草素对UUO小鼠肾组织I型胶原和α-SMA核酸表达的影响
Fig.3 Effects of cordycepin on mRNA of collagen type I and α-SMA in the kidney in UUO mice
3.4 虫草素在体外诱导NRK-52E细胞eIF2α磷酸化为进一步探讨虫草素改善肾脏纤维化的分子机制，笔者观察其对NRK-52E细胞eIF2α磷酸化的影响。

Western blot结果显示，随着虫草素干预时间的延长（0，6，12 h），p-eIF2α蛋白表达水平明显上调；与0 h相比，在6，12 h，其差异均有统计学意义（P＜0.05）（图4）。

而总eIF2α蛋白表达水平无变化。

该结果说明，虫草素能诱导NRK-52E 细胞eIF2α磷酸化。

图4 虫草素对NRK-52E细胞p-eIF2α表达的影响
Fig.4 Effect of cordycepin on p-eIF2α expression in NRK-52E cells
3.5 虫草素在体外抑制TGF-β诱导的NRK-52E细胞I型和IV型胶原表达笔
者以TGF-β（5 μg·L-1）预处理NRK-52E细胞，诱导其I型和IV型胶原核酸表达水平上升；在此基础上，当加入不同浓度（0，0.5，1，5 mg·L-1）虫草素干预后，Northern blot结果显示，I型和IV型胶原核酸表达水平均逐渐降低；与前一个干预浓度相比，在5 mg·L-1与1 mg·L-1之间，其差异有统计学意义（P＜0.05）（图5）。

该结果说明，虫草素能以剂量依赖方式抑制TGF-β诱导的NRK-52E细胞I型和IV型胶原表达。

3.6 虫草素在体外抑制TGF-β诱导的Smad蛋白磷酸化笔者同样以TGF-β（5 μg·L-1）预处理NRK-52E细胞。

Western blot结果显示，TGF-β诱导p-Smad2/3蛋白表达水平上调；当加入虫草素（5 mg·L-1）干预后，p-Smad2/3蛋白表达水平下调；与未加虫草素时相比，其差异有统计学意义（P＜0.05）（图6）。

该结果说明，虫草素能抑制TGF-β诱导的Smad蛋白磷酸化。

与前一个干预浓度相比1）P＜0.05。

图5 虫草素对TGF-β诱导的NRK-52E细胞I型和IV型胶原表达的影响
Fig.5 Effects of cordycepin on collage type I and IV expressions induced by TGF-β in NRK-52E cells
4 讨论
为了模拟人类肾脏纤维化的病变过程，笔者采用UUO的方法而建立肾间质纤维化小鼠模型。

结果显示，模型鼠结扎侧的肾脏肿大，苍白而缺血，肾盂高度扩张，肾皮质变薄；肾间质光镜下病理特征包括肾间质增宽、肾小管上皮细胞空泡变性、肾小管管腔扩大或萎缩、肾间质和肾小管出现广泛的胶原沉积。

尽管模型鼠的造模时间不长，但是，其肾间质纤维化病变特征还是比较典型的。

笔者首先观察了虫草素对UUO模型鼠肾间质纤维化的影响。

结果表明，虫草素在体内可以明显改善模型鼠肾间质纤维化程度，包括纤维化病理改变、胶原的沉积程度、α-SMA蛋白表达水平以及I型胶原核酸表达水平等。

研究表明，肾间质纤维化的特征除外细胞外基质沉积，还有各种纤维化相关蛋白在蛋白质和转录水平表达的改变。

TGF-β及其下游Smad信号通路在肾脏纤维化形成和进展过程中发挥着关键性作用[17-18]。

TGF-β主要依靠Smad信号通路来介导其
与对照组相比1）P＜0.05；与TGF-β干预组相比2）P＜0.05。

图6 虫草素对TGF-β诱导的Smad2/3蛋白磷酸化的影响
Fig.6 Effects of cordycepin on Smad2/3 phosphorylation induced by TGF-β in NRK-52E cells
细胞内外的信号转导。

TGF-β及其受体的结合诱导Smad2/3磷酸化，磷酸化
的Smad2/3（p-Smad2/3）与Smad4结合而转移至细胞核内，促进其靶基因（包括各种促纤维化因子）的转录和表达[19]。

在本课题中，笔者借助体外培养的肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞），先以TGF-β处理，观察其p-Smad蛋白的表达水平。

结果显示，TGF-β可诱导Smad2/3磷酸化，p-Smad2/3高表达，而一定浓度的虫草素不仅能够有效地抑制Smad2/3蛋白的磷酸化，同时，亦减少了其下游的I型和IV型胶原蛋白的表达。

Li等[9]报道，虫草素可抑制TGF-β1诱导的大鼠肾脏成纤维细胞（NRK-49F细胞）Smad2/3核内转移和积聚，并减少下游的α-SMA及纤维连接蛋白合成。

笔者的研究进一步证实，虫草素的抗纤维化作用的确与TGF-β/Smad信号通路有关，然而，虫草素的主要靶点是Smad磷酸化水平，而对其总蛋白水平并无明显的影响，也就是说，虫草素对TGF-β/Smad信号的抑制作用并非是干预Smad蛋白合成，而是降低其磷酸化水平。

笔者认为，这可能是虫草素改善肾间质纤维化的机制之一。

然而，有意思的是，越来越多的证据表明虫草素并不是直接作用于Smad信号途径的。

笔者发现，对于体外培养的NRK-52E细胞，虫草素首先促进的是eIF2α磷酸化水平。

eIF2α介导真核生物翻译的起始过程，磷酸化的eIF2α可引起翻译受阻[10]。

McGonigle等[11]发现，磷酸化的eIF2α可以与TGF-β受体相结合，并干扰其下游信号转导，同时，eIF2α过表达还可以直接抑制TGF-β的合成和释放。

这一结果提示，eIF2α在上游调控TGF-β及其信号通路；虫草素促进eIF2α磷酸化而直接与TGF-β受体结合，再影响其下游信号。

这可能与其经典的翻译抑制作用无关。

因此，虫草素抗肾脏纤维化的作用可能还有另外的分子靶点，也就是eIF2α/TGF-β/Smad信号通路。

总之，借助UUO模型和NRK-52E细胞模型，笔者阐明，虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用，它可能是通过诱导eIF2α磷酸化，抑制TGF-β/Smad 信号通路中的关键信号分子——p-Smad2/3表达，减少肾组织胶原和α-SMA表达等途径而改善肾间质纤维化。

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Mechanisms of cordycepin on improving renal interstitial fibrosis via
regulating eIF2α/TGF-β/Smad signaling pathway
GU Liu-bao1，2，BIAN Rong-wen1*，TU Yue3，HU Hao3，WAN Yi-gang4，SUN Wei3
（1. Department of Endocrinology，Jiangsu Province Official Hospital，Nanjing 210024，China；
2. Department of Molecular Signaling，University of Yamanashi，Yamanashi 409-3898，Japan；
3. Research Institute of Kidney Disease，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210029，China；
4. Nanjing Drum Tower Hospital，The Affiliated Hospital of Nanjing University Medical School，Nanjing 210008，China）
[Abstract] Objective：To investigate the effects and mechanisms of cordycepin，an effective component of cordyceps militaris，on renal interstitial fibrosis（RIF）and its related eIF2α/TGF-β/Smad signaling pathway. Method：Firstly，15 C57BL/6 mice were randomly divided into 3 groups，the control group（Group A），the model group （Group B）and the cordycepin-treated group（Group C）. After renal interstitial fibrotic model was successfully established by unilateral ureteral obstruction（UUO），the mice in Group C were intraperitoneally administrated with cordycepin（5 mg·kg-1·d-1）and the ones in Group A and B were administrated with physiological saline for 5 days. At the end of the study，the obstructed kidneys were collected and detected for the pathological changes of RIF，and the mRNA expressions of collagen type I（Col I）and α-smooth muscle actin（α-SMA）in the kidney by Northern blot. Secondly，after renal tubular epithelial（NRK-52E）cells cultured in vitro were exposed to transforming growth factor（TGF）-β with or without cordycepin，the mRNA expressions of Col I and collagen type IV（Col IV）by Northern blot，and the protein expressions of eukaryotic initiation factor 2α（eIF2α），phosphorylated eIF2α（p-eIF2α），Smad2/3 and phosphorylated Smad2/3（p-Smad2/3）were tested by Western blot. Result：In vivo，cordycepin alleviated RIF in model mice，including improving fibrotic pathological characteristics and mRNA expressions of Col I and α-SMA. In vitro，cordycepin induced the high expression of p-eIF2α，and inhibited the expressions of p-Smad2/3，Col I and Col IV induced by TGF-β in NRK-52E cells.
Conclusion：Cordycepin attenuates RIF in vivo and in vitro，probably by inducing the phosphorylation of eIF2α，suppressing the expression of p-Smad2/3，a key signaling molecule in TGF-β/Smad signaling pathway，and reducing the expressions of collagens and α-SMA in the kidney.
[Key words] cordycepin；renal interstitial fibrosis；eIF2α/TGF-β/Smad signaling pathway
doi：10.4268/cjcmm20142104。