虫草素调控eIF2α／TGF—β／Smad信号通路改善肾间质纤维化的机制

虫草素调控eIF2α／TGF—β／Smad信号通路改善肾间质纤维化的

机制

目的：观察冬虫夏草主要有效成分——虫草素（cordycepin）对肾间质纤维化及其eIF2α/TGF-β/Smad信号通路的干预作用和机制。方法：将15只C57BL/6小鼠随机分为对照组、模型组和虫草素组，建立小鼠单侧输尿管结扎（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化模型，虫草素组小鼠经皮下注射虫草素（5 mg·kg-1·d-1），同时，以生理盐水干预对照组和模型组，共5 d。实验结束后，取小鼠结扎侧的肾脏，观察肾间质纤维化病理特征，并测定肾组织I型胶原（collagen type I，Col I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）核酸表达（Northern blot）；另外，在体外培养大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E 细胞），在转化生长因子（transforming growth factor，TGF）- β联合或不联合虫草素干预后，观察I型胶原、IV型胶原（collagen type IV，Col IV）核酸表达的变化（Northern blot），并检测eIF2α、磷酸化eIF2α（phosphorylated eIF2α，p-eIF2α）以及Smad2/3、磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3）蛋白表达的变化（Western blot）。结果：虫草素在体内改善模型鼠肾间质纤维化，包括纤维化的病理特征以及I型胶原、α-SMA核酸的表达；虫草素在体外促进NRK-52E 细胞p-eIF2α的高表达，抑制TGF-β诱导的p-Smad2/3以及I型、IV型胶原的表达水平。结论：虫草素在体内有改善肾间质纤维化的作用，它可能是通过诱导eIF2α磷酸化，抑制TGF-β/Smad信号通路中的关键信号分子——p-Smad2/3表达，减少肾组织胶原和α-SMA表达等途径而改善肾间质纤维化。

标签：虫草素；肾间质纤维化；eIF2α/TGF-β/Smad信号通路

肾间质纤维化是各类慢性肾脏病（chronic kidney disease，CKD）发展至终末期肾病的基本环节[1]。目前，冬虫夏草（cordyceps militaris）及其制剂在临床上被广泛应用于治疗各种CKD，而且，对肾脏纤维化有一定的改善作用[2]。研究表明，冬虫夏草制剂可以拮抗5/6肾切除大鼠肾脏纤维化的进展[3]，还可以减少糖尿病大鼠肾组织转化生长因子（transforming growth factor，TGF）-β的产生以及α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、IV型胶原（collagen type IV，Col IV）的表达[4-5]。虫草素（cordycepin）是冬虫夏草的主要有效成分[6]，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化应激、抗衰老等多种功效[7-8]。据报道[9]，虫草素可抑制TGF-β信号及其诱导的α-SMA和纤维连接蛋白（fibronectin，FN）合成。然而，虫草素保护肾损伤的深层作用机制尚未完全阐明。

真核翻译起始因子（eukaryotic translation initiation factor，eIF）2α在真核生物核酸翻译起始过程中介导起始转移核糖核酸（trasfer RNA，tRNA）与核糖体的结合，它是核酸翻译的关键调控因子之一。激活eIF2α可抑制eIF2β亚单位活性，影响eIF2-GTP形成，进而引起核酸翻译受阻[10]。据报道，在水貂的肺上皮细胞（Mv1Lu细胞）中，过度表达的eIF2α可以直接抑制TGF-β的应答，干扰其下游相关信号蛋白的合成与表达[11]；笔者既往研究[12]表明，虫草素可促进eIF2α磷酸化。因此，笔者推测，虫草素可能通过活化eIF2α信号，引起翻译

抑制，发挥调控Smad信号通路活性的作用。在本课题中，笔者首先在体内观察虫草素对小鼠单侧输尿管结扎术（unilateral ureteral obstruction，UUO）肾间质纤维化模型的干预作用；其次，通过体外实验，观察虫草素对肾小管上皮细胞eIF2α磷酸化及TGF-β/Smad信号通路的影响，最终，揭示其改善肾间质纤维化的可能机制。

1 材料

1.1 动物体重约20 g的C57BL/6雄性小鼠（SPF）购自并饲养于日本山梨大学（University of Yamanashi）动物实验中心。所有小鼠均给予标准饮食，并自由饮水。小鼠适应性饲养1周后开始正式实验。

1.2 药物与试剂虫草素购自Sigma-Aldrich公司，重组TGF-β购自R&D System公司。抗总eIF2α抗体购自Santa Cruz Biotechnology，抗磷酸化eIF2α（phosphorylated eIF2α，p-eIF2α）抗体、抗α-SMA抗体、抗磷酸化Smad2/3（phosphorylated Smad2/3，p-Smad2/3）抗体、抗Smad2/3抗体、β-actin抗体以及辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）标记的相应二抗均购自于Cell Signaling公司。总RNA提取试剂盒购自Promega公司。

2 方法

2.1 肾间质纤维化模型制作参照Chevalier的方法[13]进行UUO手术。小鼠经麻醉后分离左侧输尿管，以0号丝线在2处不同部位完全结扎；对照组仅接受麻醉、打开腹腔并分离左侧输尿管，但不进行结扎操作。2.2 动物分组及给药将15只小鼠随机分为3组，即对照组、模型组和虫草素组。自建立UUO模型当日开始，虫草素组小鼠经腹腔注射给予虫草素（5 mg·kg-1·d-1），对照组和模型组小鼠仅给予同体积的生理盐水，每日1次。在手术后第5天处死小鼠，并分离左侧肾脏，用于组织学染色、免疫组织化学染色（简称“免疫组化”）以及核酸、蛋白质分析。

2.3 细胞培养及干预措施体外培养实验采用大鼠肾小管上皮细胞（NRK-52E细胞）进行（购自日本ATCC细胞库）。使用DMEM/F-12培养液（Hyclone公司）+5% FBS（Sciencell公司）+1×105 U·L-1的青、链霉素（Hyclone 公司）；在37 ℃，5%CO2培养箱中进行培养。每天观察细胞数量及形态，待细胞生长汇合至80%时，用0.25%的胰蛋白酶（Hyclone公司）消化5 min，至贴壁细胞漂浮后，予5 mL含5%FBS的完全培养基终止消化，轻轻吹打，制成单细胞悬液，于低速离心机中1 000 r·min-1离心4 min，吸引器吸出上清液，往分离出来的细胞团块中加入适量培养基，吹打混匀。取处于对数生长期的细胞进行实验。体外实验中加入虫草素（0.5，1，5 mg·L-1），联合或不联合TGF-β（5 μg·L-1）进行干预。

2.4 蛋白质分析采用Western blot进行蛋白质分析。将分离的肾皮质加入含蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂和苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）的总蛋白裂解液中，在电动匀浆机匀浆后，离心，取上清液。提取总蛋