D-对羟基苯甘氨酸的生产工艺

D-对羟基苯甘氨酸的生产工艺
摘要
药品是与人民生活息息相关，保证人民生命健康的特殊商品。

医药行业是关系民生的重要行业。

发展自己的民族制药业。

我所在的顶岗实习单位是联邦制药（内蒙古）有限公司。

主要生产阿莫西林等药物，阿莫西林的作用机理是通过抑制细菌细胞壁合成而发挥杀菌作用，可使细菌迅速成为球状体而溶解、破裂。

我国阿莫西林类药物都将保持一个较快的速长态势。

而发酵生产水平的高低取决于生产生产菌种，发酵工艺和后提炼工艺三个因素。

我所在的车间的D酸车间，我们车间负责生产联邦的又一新产品—阿莫西林的中间体D—对羟基苯甘氨酸。

车间利用微生物发酵的方法来生产D—对羟基苯甘氨酸，采用了比较先进的生产工艺，我就对它做简单的介绍。

关键词：菌种，发酵工艺，后提炼，微生物发酵
目录
第一章：微生物发酵概述
1.1：发酵培养基
1.2：灭菌
1.3：种子扩大培养
1.4微生物的生长
1.5 ：:微生物的营养需求
1.6：微生物发酵控制
第二章；发酵产物的提取
2.1：转化
2.2：过滤
2.2.1：膜过滤
2.2.2：活性炭过滤
2.3：结晶
2.4：离心
2.5干燥
第一章微生物发酵概述
D-对羟基苯甘氨酸酸的发酵是典型的代谢控制发酵，也是好气性纯种发酵，在培养基配制及灭菌，种子扩大培养，空气除菌，发酵过程的检测及控制等环节十分关键，
D—对羟基苯甘氨酸外观为白色结晶粉末，是合成半合成青霉素和头孢
菌素的中间体，用于制造羟氨苄青霉素（阿莫西林amoxicillin）和头孢羟
氨苄。

我所在的车间采用微生物发酵来生产D—对羟基苯甘氨酸，为比较先
进的生产工艺，产品是否合格与每个工段及环节有着至关重要的联系。

在管
理上采用新老思想的结合，对车间的发展起到关键性的因素。

1、发酵培养基
在发酵工程中，拥有良好生产菌种是前提。

在正常生理条件下，微生物依靠
自身代谢调节系统，趋向于快速生长和繁殖，而发酵则需要微生物积累大量的代
谢产物。

微生物生长所需要的营养物质应该包括所有组成细胞的各种化学元素，
这些营养物质可分为水，碳源，氮源，无机盐，生长因子等五大类。

选取培养基的原则是：能满足生产菌生长，代谢的需要。

目的代谢产物要高。

产物的率最高。

产生菌生长及代谢迅速。

减少代谢副产物的生成。

价廉并且具有
稳定的质量。

来源广泛且供应充足。

有利于发酵过程的溶氧与搅拌。

有利于产物
的提取和纯化。

废物的综合利用性强且处理容易。

发酵培养基的配制原则：1.根据生产菌株的营养特性配制培养基。

2.营养成
分的配比恰当。

3.渗透压。

4.PH。

还有注意各营养成分的加入次序以及操作步骤
尤其是一些微量营养物质，如生物素，维生素等，更要注意避免沉淀生成或破坏
而造成损失。

2灭菌
在发酵过程中，如果污染了杂菌，杂菌将与生产菌争夺营养物质，溶氧等，甚至会消耗氨基酸产物，造成损失；由于杂菌的繁殖，且导致产物的提取，精制变得困难；若杂菌污染严重或发生噬菌体污染，生产过程将会失败。

灭菌是防止染菌的关键，为了防止染菌，车间对灭菌十分重视，凡是与产生菌接触的培养基，发酵罐，管路，通入的空气，其它相关器具以及无菌室的空间都要经过严格灭菌。

常用的灭菌的方法有：1.化学药剂灭菌法，如75%的酒精，5%的苯酚，0.25%新洁尔灭等。

2.辐射灭菌法：紫外线，高能电磁波，放射性物质3.干热灭菌法：在160℃下维持1h。

4.火焰灭菌法：利用火焰灭菌。

5.湿热灭菌法：利用饱和蒸汽进行灭菌。

6.过滤除菌法：用过滤方法。

在发酵企业，由于蒸汽容易获得，且价格比较低廉，故培养基和发酵设备一般使用湿热法进行灭菌。

它灭菌的好坏取决于灭菌温度和灭菌时间。

培养基灭菌：在各种微生物都有一定的最适温度范围。

当温度超过微生物最适温度的上限时，微生物细胞的蛋白质会发生不可逆的变性，病迅速死亡。

在实践中，通常采用致死时间，致死温度，对数残留规律作为灭菌操作的依据。

影响培养基灭菌是否彻底，主要和培养基的pH；培养基成分；无机盐溶液；泡沫；培养基中的颗粒。

培养基的灭菌方式：1.分批灭菌（实消）记在发酵罐内，整批培养基与设备同时经过加热升温，保温，降温等操作而达到灭菌的过程。

2.连续灭菌（连消）即在一套专门灭菌设备中，培养基连续进料，瞬时升温，短时保温，尽快降温，完成灭菌操作后才进入发酵罐的过程。

连消是发酵罐采用高温短时灭菌的连续操作过程，培养基营养成分的破坏较少，有利于提高发酵产率，整个过程占用发酵设备的操作周期较少，发酵罐的利用率高，整个过程使用蒸汽均衡，可采用自动控制，减轻劳动强度。

工业生产中，大批量的培养基普遍采用连消工艺。

空气除菌：氨基酸发酵是好氧性发酵，产生菌的生长和产物合成都需要消耗大量的氧气。

在工业生产上，通常以空气作为微生物所需氧气的来源。

但是，大量各种微生物悬浮于空气中，若随空气进入发酵培养基，在合适的条件下就会大量繁殖，消耗培养基的营养物质，产生各种副产物，从而破坏了纯种培养的发酵进程，严重时易导致倒灌。

因此，发酵必须使用洁净无菌的空气，空气除菌是正常发酵的一个关键。

空气除菌就是除去或杀死空气中的微生物。

其方法有：加热灭菌；辐射灭菌；经典灭菌；过滤除菌。

常用的过滤介质要求具有吸附性强，耐
高温；阻力小等。

深层过滤常用的介质有棉花，玻璃纤维，烧结材料，活性炭，过滤器等。

介质深层过滤机理：1惯性撞击滞留作用。

2拦截滞留作用3布朗扩散作用。

4重力沉降作用5静电吸附作用。

绝对过滤除菌：是介质之间的孔隙小于被滤除的微生物，当空气流过介质层后，在空气中的微生物被滤除。

主要的介质有：聚偏氟乙烯，聚四氟乙烯等。

空气过滤除菌流程：
1.两级冷却，分离，加热的空气除菌流程：空气✂粗过滤器✂经过空气
压缩机✂储罐✂经过冷却器✂旋风分离器✂冷却器✂丝网分离器✂加
热器✂过滤器✂无菌空气。

在流程中，压缩空气经过一级冷却至温度
30~35℃，大量油，水凝结成较大雾滴，由旋风分离器去除；再经过
二级冷却至温度20~25℃，使空气进一步析出较小雾滴，采用丝网分
离器分离；最后利用加热器加热，把空气的相对湿度降低至50%℃左
右，保证过滤介质在干燥条件下过滤。

这个是适应于空气湿含量较大
的地区。

2.冷却空气直接混合式除菌流程：空气✂粗过滤器✂空气压缩机✂储罐
✂冷却器✂丝网分离器✂总过滤器。

适用于气候寒冷，干燥的地区。

空气的温度低，相对湿度低，经压缩，冷却后析出的油和水很少，混
合后的空气湿度保持在60%以下，还可以满足过滤介质除菌的干燥条
件。

·3种子扩大培养
：种子扩大培养的一般流程：保藏菌种✂斜面活化✂摇瓶培养✂种子罐培养✂发酵罐。

一般氨基酸发酵生产上，在生产车间以种子罐进行种子培养。

种子罐的大小需根据发酵工艺要求和发酵罐容量大小来确定，目前氨基酸生产工艺一般要求接种量为10%左右，故种子罐容积为发酵罐的10%左右。

如果发酵罐容积极大，而菌种生长又比较缓慢，可考虑采用多级种子罐完成种子的扩大培养。

在种子扩大培养中，越接近发酵罐的培养级数，其培养基组成越接近发酵培养基，以有利于种子接入发酵罐后尽快适应发酵培养基。

根据种子罐培养基的量而决定培养基灭菌操作方式，采用实消或连消，灭菌后降温至培养温度，等待接种。

在接种时，在火焰范围内将一级种子瓶的软管套在种子罐的接种管上，一级种子与种子罐连通后，通过急剧排除种子罐内的空气，是一级种子瓶与种子罐之间产生气压差，
而将一级种子液压进种子罐。

培养过程中，主要控制温度，PH，通气量等条件，并定时取样进行化验和镜检，如检验残糖和显微细胞观察等。

培养成熟的种子液经取样检验正常后，方可移接下一级。

影响种子质量的主要因素：培养基，接种龄，接种量，温度，PH，通气与搅拌，泡沫
4微生物生长
微生物的生长可以用微生物生长曲线来描述其生长阶段，微生物生长曲线是以微生物数量即活细菌个数或细菌重量为纵坐标，培养时间为横坐标画得的曲线。

一般说，微生物重量的变化比个数的变化更能在本质上反应出生长的过程。

曲线可分为三个阶段即生长率上升阶段、生长率下降阶段及内源呼吸阶段。

单细胞微生物典型生长曲线分为延滞期即适应期、指数期、稳定期和衰亡期四个时期。

各个时期的特点是：停滞期：（1）细胞物质开始增加；（2）有的细胞开始不适应环境而死亡；（3）细菌总数下降；（4）停滞期末期，细胞代谢活动能力强，细胞中RNA含量高，嗜碱性强。

对不良环境条件较敏感，呼吸速度、核酸及蛋白质的合成速度接近对数细胞，并开始细胞分裂。

对数期：（1）菌体以几何数增加，增长速度快；（2）细胞代谢能力最强；（3）细菌很少死亡或不死亡。

稳定期：（1）生长速率下降，死亡率上升；（2）细胞数达到最大值，新生的细菌数和死亡的细菌数相当。

衰亡期：（1）死亡率增加，细菌少繁殖或不繁殖；（2）细菌常出现多形态、畸形或衰退型，有的会产生芽孢。

5微生物营养要求
微生物生长繁殖所需的营养物质主要有水、碳源、氮源、无机盐和生长因子等。

（1）水：水是各种生物细胞必需的。

水是良好的溶剂，微生物的新陈代谢过程中的一切生化反应都离不开水的作用。

（2）碳源：碳源是合成菌体成分的原料，也是微生物获取能量的主要来源。

整体上看来，微生物可以利用的碳源范围极广，从大类上说，可以分为有机碳源和无机碳源两大类，凡必须利用有机碳源的微生物就是异养微生物，凡能利用无机碳源的微生物就是自养微生物。

糖类是最广泛利用的碳源。

（3）氮源：氮源主要是供给合成菌体结构的原料，很少作为能源利用。

与碳源相似，微生物作为一个整体来说，能利用的碳源种类十分广泛。

某些微生物
（如固氮菌）能利用空气中分子态的氮或利用无机氮化物如铵盐、硝酸盐合成有机氮化物。

多数致病菌则必须供给蛋白胨、氨基酸等有机氮化物才能生长。

（4）无机盐类：无机盐主要可为微生物提供除碳、氮以外的各种重要元素。

微生物需要的无机盐类很多，主要有P、S、K、Na、Ca、Mg、Fe等，其主要功能为构成菌体成分；调节渗透压；作为某些酶的成分，并能激活酶的活性等。

（5）生长因子：有些微生物虽然供给它适合的碳源氮源和无机盐类，仍不能生长，还要供给一定量的所谓“生长因子”。

其种类很多，主要是B族维生素的化合物等。

生长因子可以从酵母浸出液、血液或血清中获得。

6、微生物发酵控制
微生物发酵是利用微生物，在适宜的条件下，将原料经过特定的代谢途径转化为人类所需要的产物的过程。

微生物发酵所需的培养基必须包括微生物所需的五大营养物质，且有固定比例及严格的数量与质量要求，发酵为我车间的第一道工序，培养基的正确配制则是发酵的前提，其需要玉米浆为氮源，液态葡萄糖为碳源，因为我们发酵所需的最终产品为一种诱导酶，培养基中必须加入诱导剂。

此外还有硫酸铵、硫酸镁等。

配好培养基后需要经过高温高压蒸汽灭菌来消除培养基及罐体内的杂菌，我们采取二级发酵来培养菌体。

制备好种子后在无菌条件下将种子接种至一级种子罐中，在适宜的温度及PH条件下培养种子，实现种子的一级扩大培养。

在此过程中在规定时间段里取样测量其菌体生长量，残糖量，PH，涂片看其生长情况及无菌情况。

在菌体量达到移种条件且无菌情况正常即可移种至发酵罐进行二级扩大培养，并使其诱导产酶。

在培养过程中同样需要控制适宜的温度及PH，也需在规定时间段里取样测量其菌体生长量，残糖量，PH，涂片看其生长情况及无菌情况，并测量酶活。

在菌体生长量达到要求后，并无菌正常的情况下便可放罐至提取工段的转化进行菌体收集，投放底物，利用诱导酶将底物转化为我们所需要的D—对羟基苯甘氨酸。

主要用的两种酶，海因酶和氨甲酰水解酶。

工艺控制要点
1在培养基配方中，生物素的用量直接影响D-酸的合成。

生物素的含量低，菌体得不到很好的生长。

反之，由于生物素的含量过高，会造成菌体的大量繁殖，不产或少的。

2种龄和接种量必须严格控制。

一级种子控制在11~12h，二级种子控制在7~10h。

接种量控制在1%左右。

如果种龄过长或接种量过大，都会造成菌体生长过长，提前衰老自溶，产酸量少。

反之，菌体生长缓慢，发酵周期加长，还容易染菌。

3菌种在不同的生长时期需要不同的培养温度，在工艺控制上应该满足它的需要。

一般采取三级控制，0~12h控制在32℃~34℃,12~14h控制在32~33℃，在24h以后控制在34~36℃.
4通风量影响培养液中的溶氧含量。

在菌体生长期间，通风量过大，会造成菌体代谢活动过剧，提前衰老。

在合成阶段，通风量过小，不能进行三羧酸循环，导致乳酸积累以至酸败。

应此，制药根据实际需要合理通风，在长菌期间低风量，产酸期间高风量，发酵成熟期又转为低风量，才能获得产物的大量积累。

5D-酸产菌的最适pH一般是中性或偏碱性，而且在不同的时期需要的pH不同。

为了保证发酵的正常进行，必须根据发酵液pH变化的规律，通过流加铵盐的方法及时调整发酵液的pH并补加氮源，这是保证了可以获得高产D-酸的重要措施。

通过的控制方法是当pH低于7.0时即流加铵盐，每次加量不得多于0.6%。

6要获得高产的D-酸，必须要有足够的，生长旺盛的菌体。

在实际生产中，往往采取中间补料的方法，即在发酵过程中适时，适量地补充一些生物素，营养盐和糖液。

7D-酸生产菌对杂菌和噬菌体的抵抗能力差。

所以，在发酵是要特别注意防止杂菌和噬菌体侵害。

一旦遭遇，轻者造成产酸低，难提取，重则倒灌，损失惨重
第二章提取工段工艺控制
提取工段包括转化（预处理）、膜过滤、脱色、结晶、离心干燥。

每个环节对D—对羟基苯甘氨酸的生产都至关重要，需要各个工段都严格控制工艺控制点，齐心协力做好车间的生产任务。

1、转化（预处理）
转化是提取工段的第一个环节，其将发酵罐放的发酵液，在絮凝罐里絮凝，收集菌体，并排掉上清液。

在转换罐里投放底物并加水溶解，主要底物是：苯海因，壳聚糖。

然后将收集到得菌体加到转化罐里，在合适的转化周期，在适宜的温度、通气量，PH下将底物转化为D—对羟基苯甘氨酸，转化出来的D—对羟基苯甘氨酸溶于转化液里，在这里主要控制，酸碱度，温度，控制加水量。

这里需
要测的指标有，产D-酸的含量，残糖的含量。

转化液主要测定的指标：转化罐号,批次底物投放量，菌丝体积1/4，菌丝酶活，上清液酶活，发酵液残糖的含量≥3mg/ml。

.2．、膜过滤
膜过滤环节先采用振荡筛将转化液中的粗质杂质过滤出来，将较为清澈的转化液用较为精密的陶瓷膜进行过滤，陶瓷膜属于新兴科技诞生的宠儿，它对发酵液的分离纯化起着至关重要的作用。

因此经陶瓷膜过滤后转化液中的蛋白质杂质基本除去，此液体为陶瓷膜清液，其中主要含有D—对羟基苯甘氨酸，还有一些金属离子，和一些色素。

膜过滤主要测定：样品名，透析液的含量，ph；转化液的含量，ph;原料液的含量，ph;浓缩液的含量，ph.透光。

主要参数指标：
膜层厚度：50—60μm，膜孔径0.01-0.5μm；
气孔率：44—46%；
过滤压力：1.0 Mpa，反冲压力：0.4 Mpa以下；
膜材质：双层膜，外膜TiO2；内膜Al2O3—ZrO2复合膜
碱洗膜的PH10~11
酸洗膜的PH2~3
温度为≤45℃
3、脱色
脱色为提取工段中较为辛苦及环境较为恶劣的工段，主要作用是利用活性炭将陶瓷膜清液中的色素杂质脱掉，首先将陶瓷膜清液利用泵打到脱色罐内，当中利用加热器进行升温至合适温度，在同时还得调节酸碱度。

投入一定比例活性炭硅藻土助剂，在经过规定时间的搅拌，经过脱炭器进行过滤，过滤后的液体为脱色液。

一般脱色后的透光能达到98%以上，脱色液中主要含有D—对羟基苯甘氨酸和少量活性炭不能除去的杂质。

一般脱色液的要求是透光达到98%以上，酸碱度要求小于0.05左右的波动值，产品的收率在92%以上。

脱色的好坏直接影响产品的最终定向，它是后提炼的重中之重。

主要测定指标有：脱色前的PH，含量；脱色后的PH，含量，透光。

·4.结晶
结晶是指溶质自动从过饱和溶液中洗出形成新相的过程。

结晶的主要作用是将脱色液浓缩达到使D—对羟基苯甘氨酸结晶，主要使杂质也达到最大程度的浓缩。

将脱色液打到双效蒸发器中，利用高温蒸汽蒸发脱色液，使溶液中的D—对羟基苯甘氨酸晶体析出，之后将晶体及溶液一起打入结晶罐中进行结晶，收集晶体。

在结晶中主要控制：脱色液的纯度，杂质对晶体生长的影响，其机理复杂。

有的是促进，有的抑制。

杂质影响晶体生成速度的途径也不相同。

一般来说，溶液中能够杂质含量越少越好。

因为纯度差的溶液，长晶慢，晶体小，质量差。

还有就是温度的控制：温度的高低直接影响成核速度和晶体生长速度。

在结晶操作中，尤其是在育晶阶段，希望温度稳定，才能使母液浓度与过饱和系数保持稳定。

否则，有可能影响到晶型和结晶水的变化。

还有就是，搅拌，晶种的选择。

酸碱度一般都是被结晶溶质的等电点接近，可有利于晶体的析出。

结晶的流程;即蒸发的基本流程，与蒸发流程相适应的蒸发系统是由蒸发器和冷凝器两部分组成。

蒸发器是一个换热器，有加热室和气液分离器两部分组成，溶剂蒸发产生的二次蒸汽经气液分离器与溶液分离后引出；冷凝器也是一个换热器，二次蒸汽在冷凝器内冷凝后排出系统。

蒸发系统总的蒸发速度是由蒸发器的蒸发速度和冷凝器的冷凝速度共同决定。

冷却水的PH，温度，酸度，含量。

·5.干燥
干燥：是指利用热能使湿物料湿分汽化并排除蒸汽，从而得到较干物料的过程。

干燥过程要经过一个恒速干燥阶段，在恒速干燥阶段，湿物料表面全部为非结合水，所以物料表面水分汽化的速度与纯水的汽化速度相一致。

在此有非结合的蒸汽压与空气中的水蒸气分压之差，若湿物料内部水分向表面的扩散速率等于或大于水分的表面汽化速率，则物料表面总保持湿溶状态。

在经过一个降速干燥阶段。

当湿物料中的非结合水分被干燥除去以后，进入了除去结合水的阶段。

干燥速率的下降和物料温度的上升，是物料进入降速干燥阶段的标志。

影响干燥速率的因素有：D-酸的性质，形状和结构；物料的最初，最终和临界湿含量；干燥介质的温度，温度越高，干燥速率越快。

干燥介质的温度一般应低于物料的变质温度。

还干燥介质的相对湿度，空气的相对湿度越低，则干燥速率越快。

干燥介质的流速：空气的流速越快，则干燥速率越大。

干燥介质与被干燥物料的接触情况，应该让介质跳动。

压力：干燥室的压力的大小与物料汽化速率城反比，正空干燥的应用就是为了降低干燥室的压力，使物料的水分再低压常温的温度下就能很快地汽化，从而快速干燥速率。

在D-酸生产中，先经过离心机的离心将晶体及溶液一起经过离心机进行晶体与溶液的分离，晶体进行干燥后即成为成品 D —对羟基苯甘氨酸，用的干燥技术是气流干燥技术。

气流干燥室一种连续式高效流态化干燥方法，即将颗粒状的湿物料送入高温快速的热气流中，与热气流并流，均匀分散城悬浮状态，增大无无聊与热空气的接触的总表面积，强化了热交换的作用，仅在几秒钟使物料达到干燥的要求。

被分离的液体称为母液，为节省成本，母液的处理：母液一般要检测是否变质，如果变质通过排污，排到环保车间，进
行回收有效利用。

如果没有变质，会打到脱色，就行D-酸的进一步提取。

有时还会和转化液一起套着用。

最后就是成品的包装了，包装间一定是无菌，非本岗位人员严禁进入，一定要符合QC的质检标准。

进入它，一定要穿无菌衣，进行消毒处理，包装要写清楚：生产日期，批号，药名。

干燥主要测酸吸光，碱吸光，溶解性，旋光度。

后提炼的过程：发酵液 絮凝罐（絮凝菌丝）✂转化罐（加入苯海因，壳聚糖）✂振动筛✂陶瓷膜✂中转罐✂加热器✂脱色罐（加入活性炭，硅藻土）✂脱碳器✂交接罐✂结晶罐（蒸发器和冷却器）✂离心机✂气流干燥设备✂成品
D-酸中间体检验报告单：
D-酸中间体检验报告
样品名称转化罐放罐号批号送样人送样时间
检测项目标准检验结果是不是符合标准
D-酸含量（mg/ml）≥15.00(mg/m l)
D-酸百分含量
（%）
≥97.00%
中间产物百分
含量（%）
≤0.5%
底物百分含量≤0.5%
转化周期≤50h
PH 5.50~6.3
检测结果是不是符合中间体检
验标准
检验人复核人报告日期
结论
本次设计历时近两个月，依据宁夏职业技术学院生物工程系的论文要求，题目是D-对羟基苯甘氨酸省工工艺进行。

通过对内蒙古联邦公司D-酸车（403车间）实习本着技术先进、经济合理、节省投资、操作维修方便、设备排列简洁、紧凑、整齐、美观、低成本、低消耗、低污染的原则，按照GMP的标准，对后工序（过滤）中特别是酸化进行了可行性设计和研究，同时也对前工序发酵（一级种子培养、二级种子的培养、三级发酵）也进行了简单的介绍。

本次设计是在老师的指导下最后完成的。

这次设计无论对自己的能力还是耐心都是很大的考验。